197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
18 197350 19 0,1 mól Ser/g terheléssel. Ugyanazokat az oldallánc-védő csoportokat használjuk a B lánchoz, mint amelyeket az A láncnál alkalmaztunk, beleértve a cisztein S-etil származékokat is a 10. és 22. helyeken. A 4. és 5. helyeken levő aszparagirisav gyököket N-oC-BOC- -benzil-észter származékokként adagoljuk. A glutamint a 18. helyen aktív észteres eljárással kapcsoljuk, N-oC-BOC-L-glutamin-p-nitrofenil-észtert használva dimetil-formamidban. A 2. helyzetben levő triptofán kapcsolása után 0,1% indolt adunk a Lrifluor-ecetsav védőcsoport-eltávolító reagenshez és az ezt követő mctilén-klorid mosófolyadékhoz. A peptidet tartalmazó gyanta végső súlya 12,2 g, miután a BOC csoportot az amin-terminális lizin-gyökéröl eltávolitottuk, és vákuumszáritást végeztünk. A peptidet tartalmazó gyanta egy részletét (5 g) vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük 2 ml ariizol jelenlétében 0 C° hőmérsékleten 30 percen át, és a B peptid láncot izoláljuk az A láncnál leirt módszer szerint. A nyers (S-tioetil-Cys10>22)hRLX B(l-25)-öt (1,40 g) gél-szűréssel tisztítjuk Bio-Gel P 10-en 0,1 mól/literes ecetsav oldattal, majd preparatív HPLC-vel. A gél szűréssel tisztított peptid egy 150 mg-os mintáját S-szulfonáljuk 8,3 pH-nál 3 órán át, a reakciókeveréket szűrjük, és mind a csapadékot, mind a fclülúszó-oldatot dializáljuk desztillált vízzel szemben. Az .oldható" peptid mennyisége liofilezés után 92 mg, az .oldhatatlan" peptidé 55 mg. Az S-szulfonált B-pept.id láncokat tovább tisztítjuk preparatív HPCL-vel, C-18 fordított fázisú oszlopot és 0,1% trifluorecetsav-(viz)acetonitril oldószer rendszert alkalmazva. 3.) Lánc-kombináció A szintetikus hRLX A ( 1 —24 ) és hRLX B(l-25) peptideket azzal a módszerrel kombináljuk, amelyet Chance és Hoffmann írtak le 68844/81 sz. ausztrál szabadalmi közzétételi iratban az inzulin láncokhoz, ahol az S-szulfonált peptideket A:B 2:1 arányban keverték 10 mg/ml peptid koncentrációnál 10,5 pH-jú glicin pufferben. Glicin pufferben levő ditiotreitolt adunk ez utón olyan mennyiségben, hogy összesen 1,0 merkapto-csoport jusson minden egyes S-szulfo-csoportra. A reakciókeveréket ez után nyitott edényben 24 órán át kevertetjük. Ennek az eljárásnak további módosításaként arra jöttünk rá, hogy a biológiailag aktív relaxin képződéséhez vezető lánc-kombinációs reakciót úgy lehet hatásosan végrehajtani, ha egyik vagy előnyösen mindkét peptid láncot S-tioetil-Cys származékként alkalmazzuk az S-szulfo-származék helyett, amelyet Chance és Hoffmann (lásd fentebb) inzulin esetében előírtak. Az S-tioetil Cys peplidek alkalmazásával kiküszöbölünk egy reakciót és egy' tisztítási lépést, amely a peptidcknek az S-szulfo-származékká történő átalakításához szükséges. Tapasztalataink szerint a relaxin peptidek S-szulfonálási reakciója mellékreakciókkal együtt megy végbe, amelyek nehézzé teszik az S-szulfo-peptidek tisztítását, ez pedig alacsony kitermeléshez vezet. A fenti körülményeket alkalmazva a lánc-kombinációban 0,24-3% kitermelést érünk el, Wiqvist és Paul [Acta Endocrinol., 29, 135-136 (1958)] patkány-méh összehúzódásban jelentkező biológiai aktivitás vizsgálata-; nak módszerével mérve. Példa a lánc-kombinációs reakcióra Humán relaxin (S-tioetil Cys10*11-15) A(l-24)-et |3,60 mg száraz tömeg, 2,0 mg (0,68 mól) peptidtartalom aminosav-elemzés alapján] feloldunk 200 pl 0,1 mól/literes glicin-pufferben (pl! 10,5), egy 3 ml-es, dugóval ellátott műanyag centrifuga csőben. 100 pl 0,1 mól/literes glicin pufferben (pH 10,5) oldott humán relaxin (S-szulfo-Cys10'11) B( 1 —25)—öt (1,89 mg, 1,0 mg peptidtartalom aminosav-analízis alapján) adunk hozzá és a keveréket keverjük. 0,1 mól/literes glicin-puffcrben (pH 10,5) készített dit!— otreitol (DTT) törzsoldat (1,15 pmól DTT 10 ml-hen) egy alikvot részét (15,2 pl, 1,73 /uniói DTT) adjuk hozzá a peptid-oldathoz, és rövid keverés után a reakciókeveréket 4 C° hőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk nyílt levegőn. A keveréket ez után centrifugáljuk és a felülúszó oldat egy alikvotját relaxin biológiai aktivitásra mérjük patkány-méh összehúzódási vizsgálattal. A reakciókeverék alikvotjai gátolják a patkány-méh spontán összehúzódását dózis-függő módon. Egy 75 pl-es alikvot, amely teljesen meggátolja a méhösszehúzódást, ekvivalens egy 0,70%-os lánc-kombinációs kitermeléssel, amint ez a természetes sertés relaxin standarddal (A 22-B 31) összehasonlítható. II 1 gén szekvencián alapuló további szintetikus humán relaxin peptidek A következő táblázatban felsorolt szintetikus relaxin peptideket a 2. ábrában bemutatott II 1 humán relaxin gén szekvenciából származó A és B láncokhoz tartozó aminosav-szekvenciából készítjük. Az egyedi peptid láncokat a fentebb A( 1—24 ) és B( 1—25) peptidek előállításához leirt módszer szerint állítjuk elő és tisztítjuk. Ezeknek a módszereknek egy módosítását alkalmazzuk a B(3- -25) amid és B(l-25)amid peptidekhez, ahol a PAM gyantakötést bcnzhidril-amin(BHA)-polisztirol gyantával helyettesítjük. A BHA gyanta használatú olyan peptidek keletkezését 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
