197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
16 197350 17 fentiekben leirt módon a genom klón nukleotid szekvenciájából következtettünk ki, szilárd fázisú módszerrel szintetizáljuk, a Merrifield által leírt általános elvek szerint, pl. (Bárány, G. és Merrifield, R. B.: .The Peptides’, 1-284 oldal, szerkesztettte E. Gross és J. Meienhofer, Academic Press kiadás, New York). N-oC-tercier-butil-oxi-karbonil*-4-metil-benzil-L-ciszteint (* a továbbiakban .BOC") 0,30 mmól/g mennyiségben véve kapcsolunk egy IX keresztkötéssel ellátott polisztirol gyantára, fenil-acetamido-metil (PAM) kötéssel TAM és munkatársai módszere szerint [Synthesis 12, 955-957, (1979)]. A BOC-L-CYS-PAM gyantát (8,0 g) egy Beckman 990 Modell-típusú peptid-szintetizáló edénybe visszük át és az aminosav-szekvenciát a 23. gyöktől az 1-ig elkészítjük az egyes megfelelően védett aminosavak lépésenkénti beadagolásával. Az egyes aminosavak amino-végéről a BOC védócsoportot olyan módon távolitjuk el, hogy a gyantát 30 percen át 35%-os metilén-kloridos trifluor-ecetsav oldallal kezeljük, majd semlegesítjük 15 percen át 5%-os metilén-kloridos diizopropil-etilamin oldattal. A gyantát minden kezelés után alaposan átmossuk metilén-kloriddal. A szekvenciában következő aminosavat (amelynek a-amino-csoportja BOC csoporttal és ahol szükséges, az oldalláncok funkciós csoportjai is megfelelően védettek) összekapcsoljuk a gyantával, diciklohexil-karbodiimidet (DCC) alkalmazva. A gyantát és az amino-savat keverjük metilén-kloridban 10 percen át, mielőtt a DCC-t adagoljuk, amelyet szintén metilén-kloridban oldunk. 2,5-szörös moláris aminosav- és DCC felesleget (6,0 mmól) használunk minden egyes kötéshez. 1 órás keverés után a gyantából mintát veszünk és megvizsgáljuk szabad aminosavakra, Kaiser és munkatársainak ninhidrines módszerét alkalmazva (Anal. Biochem., 34, 595-598, 1970). Ha a ninhidrines vizsgálat negatív, ez jelzi, hogy a kapcsolat teljes, és a reakció-ciklus folytatódhat a következő aminosav BOC védőcsoport eltávolításával, semlegesítésével és kapcsolásával. Pozitív ninhidrin reakció esetén a kapcsolási reakciót meg kell ismételni további aminosavval és DCC-vel. Az oldalláncban funkciós csoportokkal rendelkező aminosavak közül a következő védett termékeket alkalmazzuk: N-oC-BOC-2,6-diklór-berizil-L-tirozin; N-oC-BOC-^-klór-benzil-oxi-karbon il-L-lizin; N-oC-BOC-L-szerin-O-benzil-éter; N-oC-amil-oxi-karbonil-Nc-tozil-L-arginin N-oC-BOC-L-treonin O-benzil-éter N-cC-BOC-S-etil-merkapto-L-cisztein (az A lánc 15., 11. és 10. szekvencia-helyén levő ciszteinekhez); N-oC-BOC-L-glutarainsav-'j-benzil-észter. Az 1-24 peptid elkészítését követően a végső BOC csoportot az amin-terminálison le- 10 vő arginről eltávolítjuk, a védöcsoport-eltávolító semleges ciklust használva, majd a peptidet tartalmazó gyantát (17 g) vákuumban szárítjuk. A peptidet tartalmazó gyanta egy részét (2 g) vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük anizol (2 ml) jelenlétében 0 C° hőmérsékleten 30 percen át. A peptidet tartalmazó gyanta hidrogén-fluoriddal (HF) történő teljes érintkezési idejét a minimumon kell tartani (ne legyen több, mint 70 perc) ezért a HF-ot olajszivattyús vákuum segítségével gyorsan eltávolítjuk. A peptidet tartalmazó gyantát azután többször átmossuk etilacetáttal az anizol eltávolítása érdekében, majd a peptidet 1 mól/literes ecetsavval extraháljuk, és az oldatot liofilezzük. A nyers peptid kezdeti tisztítása gél-szűréssel történik Biogel P-10-en, 0,1 mól/literes ecetsavban. Erről az oszlopról a főcsúcsot reprezentáló frakciókat, amelyeket a kb. 3000 molekulasúlynak megfelelő helynél eluálunk, összegyűjtjük és liofilezzük. Ennek a pepiidnek az aminosav-elcmzőse jelzi, hogy az 1-24 szekvencia összes aminosavai a helyes arányban vannak jelen. Az (S-tioetil-Cys10-1M5)-hRLXA(l-24) peptid további tisztítását preparatív fordított fázisú HPLC-vel (nagynyomású folyadékkromatográfia) végezzük Waters C-18 Bondapak oszlopon, 0,1% trifluorecetsav (TFA)-(vizlacetonitril oldószer-rendszert alkalmazva. A gélszűréssel tisztított peptid egy 160 mg-os mintáját S-szulforiáljuk nátriumszulfit és nétrium-tetrationát. keverékével (teljes reakcióidő: 3 óra), Du és munkatársai módszerével [Scientia Sinica, 101, 84-104 (1961)]. Az S-szulfonálás folyamán képződött csapadékot szűréssel elkülönítjük, és mind a csapadékot, mind a felülúszó oldatot dializáljuk vízzel szemben 4 C° hőmérsékleten 48 órán át. A dializáló cső tartalmát liofilezzük, igy a felülúszó oldatból 81,4 mg, mig az S-szulfonálási reakció sorén keletkezett csapadékból 53,2 mg peptidet nyerünk. Az .oldható’ (S-szulfo Cys10-n'i5,24)hRLX A(l-24) peptid egy mintáját ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk DEAE cellulózon Tris-HCl pufferben (pH 8,3). A peptidet az oszlopról Tris-HCl pufferben levő NaCl lineáris gradiensével oldjuk le, 3,0 rnS-től 85,0 mS vezetóképességi tartományt alkalmazva. A fő csúcsot jelentő frakciókat, amelyeket 20 és 30 mS között eluálunk az ioncserélő oszlopról, dializáljuk és a peptidet liofilezéssel kinyerjük. Preparatív HPLC-t használunk az S-szulfonált peptid további tisztításához. 2.) A rövidített humán relaxin B lánc [hRLX B(l-25)] szintézise A humán relaxin B lánc 1-25 gyökeinek megfelelő aminosav-szekvenciát a fentebb leírt eljárással szintetizáljuk, 7,0 g N-oC-tercier-bulil-oxi-karbonil-O-benzil-L-szerin-fenil-acetamido-melil polisztirol gyantával kezdve, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
