197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
14 197350 15 lónál ér véget, amely az Alu 1 helyhez van kapcsolva a C peptidben (exon. II) (A* az 1. ábrában). A meghatározott nukleotid szekvenciát a kódoló területnél a aH 7 genom klónból állítjuk össze az Eco R 1 és Pst 1 fragmensek szubklónozásával M 13 mp 8-ba, majd vagy (1) közvetlenül szekvencia-analízissel, amelyet az 1. ábrában a szaggatott vonal (------) mutat az M 13 terápiátokon, vagy (2) közvetlen szekvencia-analízissel, szintetikus nukleotid primer mintákat használva, amelyet a pontozott vonalak mutatnak be (....), vagy (3) a DNS fragmensek vég-jelzésével és szekvencia-analízisével a kémiai lebontás módszerével, ezt folytonos vonal ( ) mutatja be. A szekvencia-analízishez használt primer minták a kővetkezők voltak: a: 5’ TTCGCAATAGGCA és b: 5’ GCACATTAGCT A 2. ábra mutatja be a humán relaxin gén kódoló területét. A humán preprorelaxiri aminosav- és mRNS szekvencia összehasonlítása (lásd fent) a megfelelő sertés relaxin szekvenciákkal (lent) van bemutatva a 3. ábrában. A szekvenciák sorba vannak állítva a homológia kiemelése érdekében a nukleotidazonosságoknál (amelyeket csillagokkal jelölünk) és az aminosav homológiáknál (amelyeket bekeretezett területekkel jelölünk). Az aminosavakat a B-lánc kezdetétől számozzuk. Az intron szekvenciát az exon(intron)exon határoknál kisbetűs DNS jelöléssel mutatjuk be. 1.) A genom klánok izolálása és jellemzése A humán genom kiónokat, a könyvtárnak a sertés relaxin cDNS klón egy rövid - a C peptidben levő 45-95 aminosavaknak megfelelő [Haley, J., Hudson, P., Scanlon, D., John, M., Cronk, M., Shine, J., Tregear, G. és Niall, H.: DNA 1, 155-162 (1982)] - fragmenséből (150 bp) készült vizsgálati mintákkal végzett szűrővizsgálatával azonosítottuk, amint ez a 3. ábrában látható. Ezt a fragmenst a Hpa II-vel és Hinf 1-el történő emésztéssel vágjuk ki a kiónból és ez a terület maximális homológiát mutat (71% a nukleotid szinten) a patkány és a sertés relaxin szekvenciák között. A genom klón bankból két erősen pozitív fágot, aII5 és aH7 jelzésűt, izolálunk. A pozitív kiónokat tovább jellemezzük restrikciós enzim analízissel, vizsgálati mintaként az 5’, illetve a 3’ exon területekre (amelyeket exon I-nek és exon II-nek nevezünk) fajlagos sertés relaxin cDNS két elkülönített fragmensét alkalmazva. A két fragmenst a sertés relaxin cDNS klón hasításával hozzuk létre egy egyedi Hpa II helynél, amely megfelel (néhány bázison belül) egy intron helynek a homológ patkány relaxin génben [Hudson, P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J. és Niall, II.: Nature, 291, 127-131 (1981)]. A aH5 és aII7 kiónok Sonthon folt analízise felfedi, hogy humán relaxin gén kódoló területet egy 3,4 kb-s egyedi intron szakítja meg (lásd 1. ábra). 2.) A genom kiónok szekvencia analízise Az alkalmazott stratégia szerint a a115 és aII7 teljes, restrikciós enzimekkel emésztett anyagát szubklónozzuk M 13 vektorokba, majd szűrővizsgálatnak vetjük alá, exon I-re és exon II-i-e fajlagos sertés relaxin vizsgálati mintákat alkalmazva. A pozitív szubklónokat az A. rész 4. fejezetében leirt módszereknek egy kombinációjával szekvencia-analizisnek vetjük alá. A aI17 klón exon II. területét egy 2.0 kb-s Eco R 1 fragmens tartalmazza, amely egy Eco R 1 helynél kezdődik a C peptidben és folytatódik az A lánc teljes kódoló területén át a befejező kodonig (lásd 1. ábra). Ennek a fragmensnek a szekvencia-analízisét jelentősen elősegíti az A lánc körüli területekre fajlagos nukleotid primer minták szintézise, amelyeket arra használunk, hogy közvetlenül szolgáljanak mintaként a teljes 2.0 kb fragmenst tartalmazó M 13 templáton. A C peptid megmaradó 53 bp részét tartalmazó szubklónozott Eco R 1 fragmenst az exon II-ben nem tudjuk azonosítani a vizsgálati mintaként használt sertés cDNS-el. A szekvenciát erről a területről egy szubklónozott Pst 1 fragmenssel nyerjük a AH7-ből, amely tartalmazza a teljes exon II területet. A aII5 exon II terület szekvencia vizsgálata felfed egy rendkívül rövid 70 bp-s fragmenst, amely ugyanazon az Eco R 1 helyen kezdődik a C peptidben, mint a AH7-nél (lásd 1. ábra), de egy Eco R 1 kapcsolónál végződik, ez a kapcsoló egy Alu 1 helyre van kapcsolva az eredeti genom DNS-ben a genom .könyvtár" kialakulása folyamán. így a aIIS-öL a relaxin gén inkomplett kiónjának minősítjük, és riem vizsgáljuk tovább. Az exon I terület szekvencia analízise egy kicsit komplikáltabb a szignál peptidben egy Eco R 1 hely jelenléte miatt, amely szükségessé teszi a két Eco R 1 fragmens szubklón független szekvencia analízisét. Az átfedés az Eco R 1 helyeken alátámasztja a AlIT-böl származó Alu 1 szubklón azonosítása, amely az átlupoló szekvenciákat tartalmazza. C.) A módosított humán relaxin (hRLX) A (l-2!)-R( 1-25) szintézise 1.) A humán relaxin A-lánc [hRLX A(l-24)] szintézise A humán relaxin A-lánc 1-24 gyökeinek megfelelő aminosav szekvenciáját, amelyet a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
