197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
8 197350 9 sének és a mikroorganizmusba transzformálásának általános technikája jól ismert a szakirodalomban. A találmány kiterjed azokra a prokarióta vagy eukarióta sejtekre is, amelyek a fentebb leirt transzfer vektorok bármelyikével transzformálva vannak. Egy előnyös mikroorganizmus a jól ismert Escherichia coli, de bármilyen más alkalmas mikroorganizmust is lehet használni. A jelen találmány egy további tárgya eljárás egy DNS transzfer vektor előállítására, amely vektort a humán preprorelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciák replikálásában és fenntartásában alkalmazunk, és amelyre az jellemző, hogy egy humán preprorelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciának és egy restrikciós enzimes hasítással készített DNS molekulának összekapcsolásával készül. A humán prorelaxint, valamint a humán relaxin A és B láncait kódoló dezoxinukleotid-szekvenciák replikálására és fenntartására alkalmas DNS transzfer vektorokat hasonlóképpen készíthetjük el megfelelő dezoxinukleotidokból. Az A és B peptid láncokat, valamint a prorelaxint és preprorelaxint a gén kifejeződés szokásos módszereivel készíthetjük el, azaz a megfelelően transzformált transzfer vektort tartalmazó sejt növesztésével és a sejt által termelt kívánt peptid(ck) kinyerésével és tisztításával. így a találmány magában foglalja azt. az eljárást is, amelyben egy kapcsolt fehérjét állítunk elő, amely a humán preprorelaxin aminosav-szekvenciáját tartalmazza, mint C-terminális szekvenciát és a prokarióta vagy eukarióta fehérje egy részét, mint N-terminális szekvenciát; az eljárást az jellemzi, hogy egy humán prepi'orelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazó kifejeződni képes transzfer vektorral transzformált sejt tenyészetét inkubáljuk, mindezekben a műveletekben a fentebb leírt eljárást követve. A humán relaxin A és B láncainak, valamint a humán prorelaxinnak az aminosav-szekvenciát tartalmazó kapcsolt fehérjéket hasonló módon lehet előállítani. Az így előállított kapcsolt peptid termék egy olyan kapcsolt fehérje formájában van jelen, amelyben a kívánt peptid kapcsolva van a gazdasejtre jellemző prokarióta vagy eukarióta fehérje egy részletével. Az ilyen fehérjék szintén részei ennek a találmánynak. A találmány magában foglalja az egymástól C pepiiddel elválasztott A és B peptidet tartalmazó humán prorelaxint szintetizáló eljárást, az eljárás azzal jellemezhető, hogy az említett emberi proi’elaxint kódoló, a fentebb jellemzett eljárással előállított dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazó, kifejeződni képes transzfer vektorral transzformált sejtek tenyészetét inkubáljuk az említett humán prorelaxint kódoló szekvencia kifejeződéséhez alkalmas körülmények között, és az említett sejtek tenyészlevéből vagy lizátumából a humán prorelaxint elválasztjuk és megtisztítjuk. A .számunkra érdekes peptidet a kapcsolt termékből bármilyen alkalmas, ismert hasítási eljárással ki lehet nyerni. Amint ezt már fentebb jeleztük, a transzfer vektort lehet módosítani kodon helyettesítéssel, törléssel (delécióval) és hozzáadással, és az ilyen módosítások módosított kapcsolt peplidekhez is vezethetnek. Ilyen módon megfelelő módosításokkal el lehet érni a kapcsolt peptidek hasításának megkönnyítését pl. a B/C vagy C/A láncnak elágazásánál, vagy a peptid lánc viselkedésének módosítását az ez után következő kémiai vagy biológiai műveleteknél. Amint fentebb jeleztük, a találmány szerinti módszerrel elő lehet állítani humán relaxint, prorelaxint és preprorelaxint. A relaxint az egyedi A és B láncok közvetlen kombinációjával elő lehet állítani, bármely olyan módszert alkalmazva, amely jelenleg ismeretes és alkalmazott az inzulin készítésénél. Az inzulinhoz hasonló módon relaxint lehet készíteni prorelaxinból oxidációval vagy bármilyen módszerrel, amely a relaxin fentebb ismertetett módszerekkel előállított A és B peplidjeinek merkapto-csoportjait diszulfid keresztkötéssó alakítja az A és B peptidek között, majd a C peptid lehasitásával, pl. olyan erizim-katalizált hidrolízissel, amely fajlagos a C pepiidet az A és B peptidekkel összekötő kötésekre. Következésképpen a jelen találmány humán relaxin szintéziséhez olyan módszert szolgáltat, amely a teljes hosszúságú, rövidített vagy módosított formájú relaxin A és B láncainak kombinálásából áll; a módszer a humán inzulin esetében az A és B láncok kombinációjánál önmagában ismeretes. Egy ilyen módszer az S-szulfonált A és B láncok keverékének redukciójából, majd a keveréknek oxidáció céljából levegőn tartásából áll. Úgy találtuk, hogy a fenti eljárás hatékonysága javul, ha az A és B láncok egyike vagy mindkettő S-tioetil-cisztein származék formájában van jelen S-szulfo forma helyett. Az általunk benyújtott 15413/83 (PF 4385/82) számú ausztrál közrebocsátási iratban bemutattuk, hogy a relaxin A és B láncok egyikét vagy mindkettőt le lehet rövidíteni az amino- vagy karboxi-végnél anélkül, hogy a biológiai aktivitás jelentősen csökkenne, ugyanakkor a kombináció kitermelése nő. Ezek a technikák ugyanúgy használhatók a humán relaxin előállításához. A találmány egy további tárgya egy olyan humán rclaxinanalóg előállítása, amely lényegében a termesztés B és/vagy A peptid láncok rövidített vagy módosított formáit tartalmazzák. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
