197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
10 197350 11 A találmánynak célja az is, hogy módszert szolgáltasson humán relaxin analógok előállításához, amely módszer a B és/vagy A láncok rövidített vagy módosított formájának kialakítási lépéséből és azok bármely fentebb említett módszerrel történő összekapcsolásából áll. Vizsgálataink mind sertés, mind humán relaxinnal megmutatták, hogy a relaxin-aktivitás még jelen lehet az A láncnál az A (10- -24} lerövidítésig és a B láncnál a B (10-22) lerövidítésig, bár a várható gyakorlati minimum A (4-24) illetve B (4-23). Általában az A lánc variálható A (1-24)—tői A (10-24)-ig és a B lánc B (l-32)-től B ( 10-22 )-ig. Az előnyös kombinációk a kővetkező összeállításokból származnak: A B (1-24) (1-23)-tói az (2-24) bármelyike a ( 1—32)—ig terjedő (3-24) peptidek bármelyikével. A B és/vagy A láncok módosítása a jelen találmány értelmében .genetikai' módosítást, amint ezt a fentiekben leírtuk, vagy a B és/vagy A láncok (vagy teljes hosszban, vagy rövidített formában) a találmány szerinti módszerrel történő kombinációja előtti kémiai módosítását jelentheti. Két típusú módosítást alkalmazhatunk: egyedi vagy a kombinált módosítást. Az első típus magéban foglalja egy vagy több aminosav módosítását, azok közül, amelyek a természetes vagy rövidített B és/vagy A láncban előfordulnak. Az ilyen módosítások lehetnek pl.: az aktív csoportok védelme egy vagy több aminosavon önmagában ismert módszerrel, és szükség esetén a védócsoport eltávolítása a (módosított) A és B láncok kombinálása után. Az ilyen típusú módosítások jelenthetnek acetilezést, formilezést vagy a szabad aminocsoportok beleértve az N-terminálist is másfajta védelmét; a C terminális csoport amidálását, vagy a hidroxil- vagy karboxil-csoportokon az észterképzést. A formil-csoport egy jellemző példa egy könnyen eltávolítható védőcsoportra. A módosítások második csoportja az A vagy B lácban egy vagy több természetes aminosav más aminosavakkal (beleértve a természetes aminosavak D-formáit is) történő helyettesítését jelenti. A módosításnak ez az általános tipusa magában foglalhatja egy természetes aminosav törlését a láncból vagy egy vagy több többlet-aminosav hozzáadását a láncba. Az ilyen módosítások célja az A és B lánc kombináció kitermelését növelni úgy, hogy a terméknek, vagyis a relaxinnak vagy analógjának az aktivitása megmaradjon, vagy növelni, illetve módosítani a termék aktivitását az adott kombináció-kitermeléshez. Az ilyen módosítás kiterjedhet azokra a szintetikus analógokra is, amelyeknek relaxin-blokkoló vagy -antagonists hatása van. Az első típusú módosításnak jellegzetes példája a triptofán (Trp) gyök módosítása a B 2 helyen formil-csoport bevezetésével. A második típusú módosításra példák: a Met rész helyettesítése a B 24-nél norleucinna) (Nie), valinnal (Val), alaninnal (Alá), gli— cinnel (Gly), szerinnel (Ser) vagy homoszerinnel (HoinoSer). A találmány Léhát kiterjed azokra a humán relaxin analógokra, amelyek a találmány szerint fentebb leírt módon módosított természetes vagy rövidített B és/vagy A láncokból képződnek. Az A és B peptid láncokat, valamint a prorelaxint és prop rorelaxint a gén kifejeződés szokásos módszerével lehet előállítani, vagyis a megfelelő transzformált transzfer vektort tartalmazó mikroorganizmus növesztésével és a mikroorganizmus által termelt kívánt peptid(ek) kinyerésével és tisztításával. Az így előállított peptid termék lehet kapcsolt fehérje formájában, amelyben a kívánt peptid egy prokarióta fehérje egy részével van összekapcsolva. A találmányt a továbbiakban az alkalmazott kísérleti eljárások és az ilyen módon elért eredmények leírásával illusztráljuk. a.) kísérleti eljárások 1.) Baktérium- és tág törzsek E. coli líRl-et használunk, mint baktérium gazdasejtet a rekombináns plazmidokhoz (pBR 322), amelyek sertés relaxin cDNS beiktatott részt (inzertet) tartalmaznak, amint ezt korábban leírtuk [Haley, J., Hudson, H.: DNA 1, 155-162 (1982)]. A humán genom kiónok .könyvtár'-át T. Maniatis szívesen bocsátotta rendelkezésünkre. A humán DNS részleges Hae 111/Alu 1 fragmentációjából eredő, mintegy 15-20 kb-s genom DNS fragmensek [Lawn, R. M., Fritsch, E. F., Parker, R. C., Blake, G. és Maniatis, T.: Cell, 15, 1157-1174 (1978)] kapcsolókkal vannak klónozva a Charon 4 A lambda fág vektorba [Maniatis, T., Hardison, R. E., Lacy, E., Lauer, J., O’Connell, C. és Quon, D.: Cell 15, 687-701 (1978)] és szaporítva E. coli LE 392 sejtekben. A fág DNS-t. (a klón-szelekció után) az 1 liter E. coli DP 50 sup F sejttenyészetének lizisét követően állítjuk elő. A fág DNS fragmentációjából eredő kis DNS fragmenscket szubklónozzuk a szekvencia analízishez az M 13 bakteriofág vektorokba (mp 7,1 mp 8 és mp 9), amelyeket Dr. J. Messing bocsátott szívesen rendelkezésünkre, és transzformáljuk JM 101 sejtekbe. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
