197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
6 197350 7 amely biológiailag aktiv a méh-összehúzódási vizsgálatokban. A preprorelaxin in vitro termelésének módja még nem teljesen ismert, de a sertés relaxinról a szignál peptid lehasitásának analógiája alapján az a valószinű, hogy ez a hasítás az Alá"1 Lys'1 kötésnél történik. Hasonlóképpen valószlnűsithető, hogy a C peptid hasítása a Leu^Ser33 és Arg136-Arg137 helyen történik, Így adódik ki a B lánc 32 és az A lánc 24 gyökkel. Amint a sertés relaxinnal kapcsolatos tanulmányainkban megjegyeztük, a sertés relaxin B és A láncainak vannak olyan lényeges belső szekvenciái, amelyek a biológiai aktivitás összes lényeges elemét tartalmazzák. A humán relaxin láncokkal kapcsolatos szintetikus tanulmányaink hasonló eredményeket mutatnak, amint ez későbbi részletes ismertetésünkből kiderül. A jelen találmány egyik tárgya tehát egy gén előálitása, amely a humán preprorelaxint fejezi ki. Részletesebben a jelen találmány egyik tárgya egy kettős szálú DNS fragmens előállítása, amely humán prepi-orelaxint fejez ki, és amely egy kódoló szálból és egy komplementer szálból áll, amely annak teljes a mRNS szekvenciának (-25-től 160-ig terjedő kodonok) felel meg, amely a 2. ábrában látható. A találmány magába foglalja a preprorelaxin gén szekvencia bármilyen alegységét, vagy az említett szekvencia vagy alegység bármilyen ekvivalensét. Az ebben a megállapításban említett alegységek között lehetnek olyan gének, amelyekben nem szerepelnek olyan nem-kódoló területek, amelyek a 3. ábra szerint láthatók, vagy olyan gének, amelyek a humán preprorelaxin A, B és C láncait vagy szignál peptid láncát (lásd 3. ábra) vagy ezek bármilyen kombinációját kódoló egyedi struktúrgéneket tartalmaznak. Ilyen kombináció lehet pl. egy A és B peptid láncot elkülönítve vagy preprorelaxin-szerűen (vagyis C lánccal összekapcsoltan) kifejező gén. A jelen találmány egy másik tárgya egy gén előállítása, amely a humán prorelaxint fejezi ki. Részletesebben, a jelen találmány egyik tárgya egy kettős szálú DNS fragmens előállítása, amely humán prorelaxint fejez ki, és amely egy kódoló szálból és egy komplementer szálból áll, amely annak a kodonnak felel meg, amely 1-160 számmal látható a 2. ábra szerinti mRNS szekvenciában. A jelen találmány további tárgya olyan gének előállítása, amelyek elkülönítetten ki tudják fejezni a humán relaxin A, B és C láncait, vagy az említett láncokból kettőnek vagy többnek a kombinációját. Részletesebben a jelen találmány tárgya olyan kettős szálú DNS fragmensek előállítása., amelyek elkülönítetten tudják kifejezni a humán relaxin A és/vagy B és/vagy C láncait, és amelyek a 2. ábrán látható mRNS szekvenciák 1-32, 33-136 és 137-160 számai közti kodonjainak megfelelő kódoló szálat és egy komplementer szálat tartalmaznak. A fentebb leírt gének a fajlagos kodonon kívül magukba foglalhatják a megfelelő .start" és .stop" kodonokat is, vagyis AUG-t és UGA-t (-26 és 161 kodonok a 2. ábrán). A szakmában járatosak tisztában vannak azzal, hogy a géneknek polimorf módosulatai is lehetnek. Az ilyen .módosulatok is beletartoznak a találmány körébe. A találmány magába foglalja a fenti szekvenciák komplementjeit és az alegységeket vagy ekvivalenseket is. A jelen találmány egy további tárgya egy DNS transzfer vektor előállítása, amely a fentebb meghatározott génnek megfelelő dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazza. Amint fentebb láttuk, a genetikai kód tartalmaz redundanciákat, vagyis bizonyos aminosavakat több, mint egy kodon kódol. Ennek megfelelően a találmány magába foglalja azokat a dezoxinukleotid szekvenciákat is, amelyekben az ábrákban bemutatott kodonok vagy cDNS ekvivalensei más kodonokkal vannak helyettesítve, olyan kodonokkal, amelyek szintén tudják kódolni ugyanazt az aminosavat. Továbbmenve, amint ezt korábban jeleztük, relaxin aktivitással rendelkező peptideket lehet előállítani, amelyek a B és/vagy A lánc szerkezetében különböznek a természetes relaxin lói. Az ilyen eltérések maguk után vonhatják egy vagy több aminosav törlését (delécióját) és/vagy további aminosavak hozzátételét és/vagy különböző aminosavak helyettesítését a természetes láncban. így a találmány magában foglal olyan géneket és DNS transzfer vektorokat is, amelyekben - ahogyan ezt korábban leírtuk - egy vagy több természetes kodon törölve van és/vagy helyettesítve van olyan kodonnal, amely más aminosavat kódol, mint amilyent a természetes kodon kódol és/vagy további kodonok vannak hozzáadva a természetes szekvenciához. A találmány szerinti transzfer vektorok magukban foglalhatnak többek között olyan genetikai információkat is, amelyek biztosítják azok replikációját, amikor átkerülnek egy gazdasejtbe. Ilyen sejtek lehetnek pl. prokarióta mikroorganizmus sejtek, mint pl. baktériumok, élesztők és gombák, valamint eukariótö sejtek, beleértve az emlős sejteket és sejtvonalakat is. A baktérium-genetikában leginkább használt transzfer vektorra jó példa a plazmid és bizonyos bakteriofágok DNS-ei. Mind a fág DNS-l, mind a bakteriális plazmidokat használjuk transzfer vektorként a jelen munkában. Meg kell érteni azonban, hogy más tipusú transzfer vektorokat is lehet alkalmazni. Az ilyen transzfer vektorok képzé5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
