197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
4 197350 5 A petefészkek sárgatestje, valamint a Ile Thr Asn Ser U petefészkek és placenta szövetek a Ile Thr Asn Ser C legvalószínűbb helyei a relaxinnal A Ile Thr Lys Arg A kapcsolatos gének kifejeződésének. A legtöbb Met Thr Lys Arg G peptid-hormon széleskörű elterjedésére való 5 — tekintettel azonban nagyon valószínű, hogy a Val Ala Asp Gly U relaxin-gén kifejeződik a nem-reproduktiv Val Ala Asp Gly C szövetekben, pl. az agyban és az emésztő-G Val Ala Glu Gly A traktusban is. A relaxin egy növekedési Val Ala Glu Gly G faktor általános tulajdonságaival bír és 10 — képes megváltoztatni a kötőszövetek természetét és befolyásolni a simaizom Az egyes aminosavakra használt rôvidiösszehúzódást. Úgy hisszük, hogy a jelen szabadalmi bejelentésben és a PF 7247/82. sz. ausztrál szabadalmi bejelentésben leirt 15 génszerkezetek egyike vagy mindkettő széles körben elterjedt a testben. Az a véleményünk, hogy az ezekből a génekből kifejezett relaxin-peptidek fontos fiziológiai szerepet játszanak a reprodukció során vég- 20 zett jól dokumentált hormon-funkciójukon túl is. Ebben a leírásban a következő rövidítéseket használjuk: Hl = az itt leirt relaxin gén, amely 25 a genom-klónból van visszavezetve H2 = a PF 7247/82. sz. szabadalmi bejelentésben leírt relaxin-gén, amely a cDNS kiónból 30 van visszavezetve DNS = dezoxiribonukleinsav RNS = ribonukleinsav' cDNS = komplementer DNS (enzimatikusan szintetizálva egy mRNS 35 szekvenciából) mRNS = messenger (hírvivő) RNS A = adenin T = timin G = guanin 40 C = citozin U = uracil A kódoló kapcsolatok a DNS nukleotid szekvencia és a fehérje aminosav szekvencia között együttesen mint .genetikai kód' is- 45 mertek, amelyet az alábbiakban ismertetünk. Lések a következő táblázatban láthatók Fenilalanin (Phe) Hisztidin (His) Leucin (Leu) Izolcucin (Ile) Metionin (Met) Valin (Val) Szerin (Ser) Prolin (Pro) Treonin (Thr) Alanin (Ala) Tirozin (Tyr) Glutamin (Gin) Aszparagin (Asn) Lizin (Lys) Aszparaginsav (Asp) Glutamin sav (Glu) Cisztein (Cys) Triptofán (Trp) Arginin (Arg) Glicin (Gly) Minden három betűs kódon (más néven dezoxinukleotied triplet vagy nukleotid triplet), amely a táblázatban megtalálható (pl. AUG, CAU), egy mRNS trinukleotidnak felel meg, az 5’ véggel a bal és 3' véggel a jobb oldalon. A betűk purin vagy pirimidin bázisokat jelentenek, amelyek nukleotid szekvenciát alkotják. Minden itt megadott DNS szekvencia a szálnak az a DNS szekvenciája, amely megfelel az mRNS szekvenciának, csak éppen timinnel (T) helyettesítve az uracilt (U). Az ezt követő részletes tárgyalásban utalások lesznek az ábrákra, az ábrák a következők: Az 1. ábra a két alább emlitendő genom-klón restrikciós enzim-térképe; a 2. ábra a humán relaxin gén kódoló területének mRNS szekvenciáját és a humán preprorelaxin aminosav szekvenciáját mutatja be; és a 3. ábra mutatja be a humán preprorelaxin és a hozzá tartozó mRNS szekvenciák összehasonlítását a megfelelő sertés preprorelaxin szekvenciákkal. Első helyzet (5’ vég) U Második helyzet C A Harmadik helyzet G (3’ vég) Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C U Leu Ser Stop Stop A Leu Ser Stop Trp G Leu Pro His Arg U Leu Pro II is Arg C Leu Pro Gin Arg A C Leu Pro Gin Arg G A genetikai anyag eredeti forrása a hu- 50 mán genom kiónok .könyvtár'-a volt. A .könyvtár' szűrővizsgálata sertés relaxin cDNS mintákkal két olyan kiónt adott ki, amely humán relaxint kódoló szekvenciákat tartalmazott. 55 A 2. és 3. ábrában bemutatott mRNS szekvenciákat a később leírt módszerrel határoztuk meg. Az látható az ábrából, hogy egy egyedi, 3,4 kb-s intron szakítja meg a c kapcsoló pepiid kódoló területét. A humán 60 preprorelaxin szerkezetét a genom-szekvenciából következtettük ki, összehasonlítva a sertés és patkány relaxin homológ szerkezetével. Az A és B peptid lánc szerkezetének bizonyítására szintézissel és in vitro lánc- 65 -rekombinációval olyan anyagot termeltünk, 4
