197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
2 197350 3 A találmány tárgya egy humán relaxint kódoló gén szekvencia molekuláris klónozása és jellemzése. A találmány tárgya a humán -ti relaxin, prorelaxin és preprorelaxin előállítása. Részletesebben: a találmány tárgya egy izolált és tisztított (.klónozott*) humán gén, amely prorelaxint, preprorelaxint, valamint a humán relaxin A és/vagy B és/vagy C peptid láncát kódolja, valamint eljárások a gének izolálására és tisztítására, eljárások a gének átvitelére a gazdasejtbe és azok replikálására a gazdasejtben. A klónozott géneket a gazdasejt akkor fejezi ki, amikor azok egyesültek a gazdasejt kifejeződni képes prokarióta vagy eukarióta sejtjeivel. A gének így felhasználhatók a gyógyászati célokra alkalmas humán relaxin előállításához. A találmány tárgyához tartoznak a humán relaxin, prorelaxin peptidek, valamint egyes peptid láncok, amelyek tartalmazzák ezeket a szekvenciákat és ezeknek a peptideknek módosított formáit. A találmány tárgyához tartoznak még azok a módosított gének, amelyek az egyes relaxin-láncokat és a fent említett módosított formájú peptideket kódolják. Hisaw, F. L. úttörő munkája [Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 23, 661-663 (1926)] vetette fel a relaxin peptid fontos szerepét az emlősökben, amely az ágyéktáji szimfizis tágító hatása révén jelentkezik, ilyen módon könnyítve meg a szülési folyamatot. A relaxin a petefészek sárgatestjében képződik és tárolódik a terhesség folyamán, és a véráramba a szülés előtt kerül. A rendelkezésre álló petefészkek lehetővé tették a relaxin izolálását és aminosav-összetételének megállapítását sertésben [Schwabe, C., McDonald, J. K. és Steinetz, B. C.: Biochem, Biophys. Res. Commun. 75, 503- -510 (1977); James, R., Niall, II., Kwok, S. és Bryant-Greenwood, G.: Nature, 267, 544-546 (1977)], patkányban [John, M. J., Walsh, J. R., Borjesson, B. W. és Niall, II. D.: Endocrinology 108, 726-729 (1981)], és cápában [Schwabe, C., Gowan, L. K. és Reinig, J. W.: Ann. N. Y. Acad. Sei. 380, 6-12 (1982)]. A biológiailag aktív hormon két peptidláncból áll, amelyeket A és B láncként ismerünk, és amelyeket diszulfid hidak kötnek össze, kettő a láncok között és egy a láncon belül. A szerkezet igy rendkívül hasonlít az inzulinra a diszulfid kötések elhelyezkedésében, amely ezeknek a hormonoknak a közös ős-génjére utaló feltételezésekhez vezet (lásd Schwabe ill. James, fentebb idézett irodalmi helyek). A rekombináns DNS technikát alkalmaztuk a cDNS kiónok izolálására mind a patkány, mind a sertés x-elaxinhoz [Hudson. P., Haley, J., Ci-onk, M., Shine, J. és Niall, II.: Nature, 291, 127-131 (1981); 11834/83 (PF 2696/82) ausztrál szabadalmi közrebocsátási irat. Szintetikus undekamer (11 tagú) nukleotidokat - amelyeket a rendelkezésre álló aminosav-szekvenciák alapján készítettünk -alkalmaztuk primer mintaként a relaxin cDNS szekvenciákban erősen feldúsított cDNs minták szintéziséhez, amelyek azonosnak tekinthetők azokkal a relaxin cDNS kiónokkal, amelyek a petefészek-szövetből származó gén .könyvtár"-hun találhatók. A relaxin struktúrgénről úgy találtuk, hogy egy egyedi láncból álló prekurzort kódol, amely hasonlít a preproinzulinra általános konfigurációjában, azaz: szignál-peptid(B-)ánc/C-peptid)A-lánc. A sertés és patkány preprorelaxinok egy meglepően nagy összekapcsoló peptidet tartalmaznak (105 ill. 104 gyök), összehasonlítva a patkány inzulinnal, amely mintegy 30 gyökös C pepiiddel rendelkezik. A patkány és sertés relaxin C peptidjének nagy mértékü szekvencia-homológiája feltételezi, hogy szerepük több, mint egyszerűen biztosítani a korrekt diszulfid kötés képzést az A és B láncok között. Az a véleményünk alakult ki, hogy a szerkezeti mozgás a szekvencia-eltérésben, amely az evolúció során alakult ki, a C-peptid részben eredményezett változást, amely C peptid hasonlóképpen nagy mértékű szekvencia homológiával bír a humán relaxin génben. Következésképpen, amint ezt korábban már leírtuk, mi olyan mintákat alkalmaztunk a humán relaxin gén kiválasztásában, amely inkább a sertés, mint a patkány C- peptid területen alapszik, mivel a fehérje szekvencia adatok összegyűjtése azt jelezte, hogy a humán fehérjék általában kevésbé térnek el a sertés, mint a patkány fehérjékből [Dayhoff, M. 0., Schwartz, R. M., Chen, H. R., Hunt, L. T., Barker, W. C. és Orcutt, B. C.: DNA 1, 51-58 (1981)]. Bár számtalan csoportnak hosszútávú célja volt meghatározni a humán relaxin szerkezetét és igy megállapítani a klinikai beavatkozás útját nehéz szülés esetén, a terhesség időszakából származó emberi petefészkek korlátozott hozzáférhetősége megakadályozta a közvetlen aminosav szekvencia meghatározását. A mi megközelítésünk az volt, hogy sorozatvizsgálatokat végeztünk közvetlen emberi relaxin génre egy genom- .könyvtár *-ban, a sertés relaxin cDNS egyegy területét alkalmazva mintaként. Ez a megközelítés azt eredményezte, hogy sikeresen azonosítottuk azt a genom-klónt, amelyből a preprorelaxin teljes kódoló területének szerkezetét meghatároztuk. Úgy véljük, hogy az itt leírt gének egyike vagy mindkettő, amelyeket .Hl* és ■H2* gén jelzéssel láttunk el, és amelyeket a PF 7247/82 számú ausztrál szabadalmi bejelentésben leírtunk, fejeződik ki a humán reproduktív szövetekben, pl. a petefészekben vagy a méhlepényben és/vagy más szövetekben, beleértve (de nem korlátozva ezekre) a beleket, agyat, bőrt, mivel mindkét gén kifejez relaxin-szerű aktivitást mutató peptideket. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
