197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására

19

197349

20

hőmérsékleten folytatjuk a reakciót, majd az eleggyel E. coli JA221 törzset (recA", hrs" hsm4, atrpE5, thr, leu, thi, lacY") transzformálunk. A törzs letéti száma: NRRL 15 014. A transzformáció során Wensink és munkatársai 5 módszerét használtuk [Cell, 3, 315-325

(1974)]. A transzformált telepeket 100 pg/inl ampicillint tartalmazó agarlemezeken szelektáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 16 ampicillin-rezisztens telepből izoláljuk, az előzőleg 10 megadott Birnboim-módszert, azaz a gyors alkalikus-denaturációs módszert használva. Ezután restrikciós enzimmel és gél-elektroforézissel végzünk analízist. A 16 vizsgált plazmid közül 11 tartalmazza a körülbelül 700 15 bázispárból álló BamHI fragmenst. A plazniidok egyikét pNM575 jellel jelöljük, és a 4. ábra 109. helyén mutatjuk be. Ezt a plazmidot használjuk amplifikálásra (sokszorosításra) a következőkben ismertetett plazmidok 20 előállításakor használt dezoxi-ribonukleinsav-fragmens forrásaként. Az érett humán növekedési hormon dezoxi-ribonukleinsav-szek-. venciája egyetlen PnuDII (5’-CGCG-3’) restrikciós helyet tartalmaz, ez 47 bázispárral 25 arrébb helyezkedik el az első nukleotidtól számítva. A pBR322-ben 23 ezen enzim által felismerhető hely van. 25 jug pNM575 dezoxiribonukleinsavat 25 egység BamHI enzimmel kezelünk, 250 pl BamHI pufferban. A reakciót 30 1 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. A 691 bázispárból álló és BamHI kohéziv végekkel rendelkező fraginenst 6% poliakril-amid gélről izoláljuk, és az előzőekben megadottak szerint eljárva tisztítjuk. A fragmens 1/3-át 35 (ez 8 pg plazmidnak felel meg) tisztítás után

2,5 egység FnuDII enzimmel emésztjük 100 pl FnuDII pufferban. Ennek összetétele a következő:

6 mmól nátrium-klorid, 40

6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4,

6 mmól magnézium-klorid,

6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként.

A reakciót 37 C° hőmérsékleten végezzük, 1,5 órán át. Az 538 bázispárból álló, az utolsó 175 aminosavat meghatározó szakaszt és az ezután következő transzlációs stop kodont tartalmazó fragmens izolálásét 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen végzett elektrofcrézissel ismert módon vitelezzük ki.

1. példa

Plazmid előállítása a metionil-humán növekedési hormon kifejezésére az E. coli lipoprotein promoterét használva

A) A plazmid előállítása

Foszfotriészter-módszerrel szintetizáljuk az 5. ábra 110. számmal jelzett helyén megadott kétszálú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. A fragmenst felhasználjuk az lpp promoter szakaszának kapcsolásához a humán növekedési hormont meghatározó régióhoz, a humán növekedési hormon közvetlen kifejezése céljából. A felső szál 66 nukleotidból áll, ez tartalmazza az 5’-végen az Xbal hasítás sorén létrejött 4 nukleotidból álló egyszálú szekvenciát. Az alsó szál 62 nukleotidot tartalmaz, ez a felső szál 62 nukleotidjával komplementer. A szintetikus dezoxi-ribonukleinsav-fragmens első része követi az lpp gén természetes szekvenciáját az Xbal restrikciós helytől kezdődően a riboszóma kötőhelyen át a transzláció kezdetét meghatározó metionin kodonig (19 bázispár), és ezután következik a humán növekedési hormon első 47 nukleotidja, egészen az előzőekben megadott egyetlen FnuDII helyig.

Az 5. ábra 110. helyén megadott kétszálj dezoxi-ribonukleinsav-fragmens az alábbi szerkezetű:

Xbal

5’-CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCAACCATTCCCTTATCC- 3’- TCCCATAATTATTACAAGGGTTGGTAAGGGAATAGGThal

AGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG 3’ TCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC 5’

A fragmenst az ismert foszfotriészter-módszerrel állítottuk elő, az alábbi szegmensekből:

1)

CTAGAGGGTAT

2)

TAATAATGTTCC

3)

CAACCATTCCC

4)

TTATCCAGGC

5)

TTTTTGACAACG

6)

CTATGCTCCG

7)

CATTATTAATACCCT

8)

GGTTGGGAA

9)

GGATAAGGGAAT

10)

GTCAAAAAGCCT

11)

CGGAGCATAGCGTT.

A fentiekben megadott szegmensek felhasználásával az alábbi három duplexet állítjuk elő.

50 a) Az 5’-nem-foszforilezett 1. szegmenst T4 ligázzal 5’-foszforilezett 7. szegmens jelenlétében hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezet. 2. szegmenshez. Ily módon ismert módszerek szerint eljárva [Brown és munkatár- 55 sai, Methods in Enzymology, 68, 109-151

(1979)] megkapjuk az 1. duplexet. A duplexet preparatív gél-elektroforézissel izoláljuk 15%-os poliakril-amidon.

b) A3. 5’-foszforilezett szegmenst T4 li- 60 gázzal 5’-foszforilezett 8. és 9. szegmens jelenlétében hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezeti. 4. szegmenshez, amiután megkapjuk a 2. duplexet. Ezt 15%-os poliakril-amidon préparât! v gél-elektroforézissel izoláljuk. A reak- 65 ciót a fentiek szerint végezzük.

11