197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
21 197349 22 c) Az 5. 5’-foszforilezett szegmenst T4 ligázzal 5’-foszforilezett 10. szegmens és 5’-nem-foszforilezett 11. szegmens jelenlétében ligáljuk a 6. szegmens 5’-foszforilezett alakjához, amiután megkapjuk a 3. duplexet. A duplexet 15%-os poliakril-amidon preparativ gél-elektroforézissel izoláljuk. Az 1., 2. és 3. duplexeket ezután T4 li~ gázzal összekapcsoljuk, miután megkapjuk az 5. ábra 110. helyén megadott kétszálú dezoxi-ribonukelinsav-szegmenst, amit 15%-os poliakril-amidon preparativ gél-elektroforézissel izolálunk. Ezt a terméket 5’-végein T4 polinukleotid-kinázzal (gamma-P32)ATP jelenlétében enzimatikusan foszforilezzük. A reakciót ismert módszerekkel végezzük. A kifejeződő plazmid előállítására 0,1 pikomól (0,4 mg) plazmid vektort (5. ábra 107. helyén adjuk meg), 3,2 pikomól szintetikus dezoxi-ribonukelinsav-fragmenst (5. ábra, 110.) és 0,24 pikomól (0,08 Mg) 538 bázispárból álló fragmenst (lásd az előzőeket, 5. ábra, 109.) 2 egység T4 dezoxi-ribonukelinsav-ligázzal enzimatikusan kapcsolunk 14 pl ligációs pufferban. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd az előzőekben megadottak szerint eljárva, E. coli JA221 sejteket transzformálunk. A transzformált telepeket 100 ug/ml ampicillint tartalmazó agarlemezeken szelektáljuk. Az előzőekben megadott Birnboim-módszerrel 10 telepből izoláljuk a plazmidokat. A plazmídokat Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd akril-amid gél-elektroforézist végzünk, amiután úgy találjuk, hogy egy plazmid tartalmazza a vért, 604 bázispárból álló fragmenst. Ezt a plazmidot sokszorosítjuk, és az Xbal helytől az FnuDII helyig terjedő dezoxi-ribonukelinsav-szekvencíát Maxam és Gilbert módszerével meghatározzuk [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 560-564 (1977) ]. A szekvencia korrekt. A plazmidot pNM645 jellel jelöljük, és az 5. ábra 111. helyén ismertetjük. B) A humán növekedési hormon kifejezése A pNM645 plazmid által E. coli JA221 sejtekben kifejezett humán növekedési hormont módosított, szilárd fázisú radioimmun-méréssel mutatjuk ki [a módszert lásd az alábbi közleményekben: Broome és Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 75, 2746-2749 (1978) ; Hitzeman és munkatársai; ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, 14, 57-58 (1979); és Erlich és munkatársai, Cell., 13, 681-689 (1978)]. A baktériumsejt proteinjeinek nátrium-dodecil-szulfát-poliakril-amid gélanalizisét Leammli szerint végezzük [Nature, 227, 680- -685 (1970)], a vizsgálatok szerint egy körülbelül 20 000 dalton molekulasúlyú nagy protein csík jelenik meg. A csík az összprotein legalább 10%-át képviseli, ugyanakkor nincs jelen a pKEN021 plazmidot tartalmazó 12 E. coli JA221 készítményekben. A kvantitatív kifejeződést standard radioimmun-méréssel vizsgáltuk [Twomey és munkatársai, Clin. Chem., 20, 389-391 (1974)]. A vizsgálatok szerint sejtként legalább 2 millió molekula van jelen. A metionil-humán növekedési hormon 500 g E. coli sejtből részlegesen tisztítjuk 8 mól/1 karbamid és 1% Triton X100 extrakcióval. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk, és az oldódó növekedési hormont tartalmazó felülúszót. Whutman DE52 oszlopon frakcionáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat radioimmun-méréssel (RIA) határozzuk meg, ezeket összegyűjtjük és izoelektromos kicsapást végzünk. A terméket Whatman SE53 oszlopon tovább tisztítjuk. Radioimmun-méréssel meghatározzuk a terméket tartalmazó frakciókat, és az anyagot izoelektromos kicsapással vagy ultraszűréssel töményítjük. A kinyert metionil-humán növekedési hormon biológiai aktivitását hipofízis-ektomizált nőstény patkányokban határozzuk meg Greenspan és munkatársai szerint [Endocrinology, 45, 455-463 (1948)]. Aktivitása azonos volt a humán növekedési hormon aktivitásával. 2, példa A metionil-marha növekedési hormon kifejezésére alkalmas plazmid előállítása az E. coli lipoprotein promoter felhasználásával. A 6. ábra 111. számmal jelzett helyén megadott pNM645, a metionil-humán növekedési hormon kifejezésére használt plazmidot használjuk fel a metionil marha növekedési hormon kifejezésére alkalmas plazmid elóállitására. A marha növekedési hormon génjeinek egy részét meghatározó szekvenciát tartalmazó két dezoxi-ribonukleinsav-fragmens forrásaként a Miller és munkatársai által leírt pBP48 plazmidot használjuk [J. Biol. Chem., 225, 7521-7524 (1980)]. A plazmid a marha növekedési hormont meghatározó szekvenciát egy 831 bázispárból álló szakaszon tartalmazza, ezt a pBP322 PstI (5’-CTGCAG-3’) restrikciós helye hordozza, A marha növekedési hormont meghatározó szekvenciát Miller és munkatársai módszere mellett megkaphatjuk Goodman és munkatársai szerint eljárva is, a marha agyalapi mirigyéből izolált mRNS segítségével [Methods in Enzymology, 68, 75-90 (1979)]. A humán és a marha növekedési hormont meghatározó szekvencia igen hasonló, és sok homológiát mutat. A marha növekedési hormont kifejező plazmid előállításakor különösen előnyösen használhatjuk azokat a fragmenseket, amelyeket a PvuII restrikciós enzimmel (5’-CAGCTG-3’) végzett emésztéssel kapunk. A keletkező fragmensek 497 bázispárból állnak a humán növekedési hormon, és 494 bázispárból a marha növekedési hormon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
