197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
17 197349 18 0,5 pg, 950 bázispárból álló fragmenst kapunk, ezt tisztítjuk, és TEN-oldatban oldjuk. 0,2 pg fragmenst 20 m1, 20 pikomól foszforilezett BamHI linkért (5’-CCGGATCCGG-3’, Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó T4 dezoxiribonukleinsav-ligáz-pufferban oldjuk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a ligáz inaktiválására 10 percen át 65 C° hőmérsékleten. A dezoxi-ribonuklein8avat 100 pl-re hígítjuk 20 egység BamHI enzimet tartalmazó BamHI pufferral. 2 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd dezoxi-ribonukleinsavat 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk a fölös linker molekulák eltávolítására. A BamHI és Sáli kohéziv végekkel rendelkező 950 bázispárból álló fragmenst elkülönítjük és tisztítjuk. A fragmenst 20 m1> az előzőekben leírt 0,2 Mg mennyiségű klónozó vektort és 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-pufferban oldjuk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd az eleggyel E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A plazmidokat izoláljuk az ampicillinrezisztens transzformánsokból, és vizsgáljuk a 950 bázispárból álló Sáli, BamHI fragmens jelenlétét. Az előállítani kívánt, 5,2 kb nagyságú plazmidot pKEN021 jellel jelöljük, és a 3. ábra 106. számmal jelzett helyén mutatjuk be. 10 Mg pKEN021 dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység BamHI enzimmel kezelünk 1 órán át 37 C° hőmérsékleten, 200 m1 alábbi összetételű Xbal/BamHI pufferban: 150 mmól nátrium-klorid, 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 8, 10 mmól magnézium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. Az emésztést 10 egység Xbal enzimmel megismételjük, a reakciót 1 órán át 37 C° hőmérsékleten végezzük. A dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 órán át 65 C° hőmérsékleten, 2,5 egység alkalikus foszfatázzal kezeljük, majd fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanolos kicsapással összegyűjtjük, és 50 mí alábbi összetételű TEN-oldatban oldjuk: 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 7,4, 10 mmól nátrium-klorid, 1 mmól etilén-dinitril-tetraecetsav, literenként. A dezoxi-ribonukleinsavat úgy oldjuk, hogy a reakcióelegy pl-enként 0,2 Mg-ot tartalmazzon. Ezt a 3. ábra 107. számmal jelölt helyén bemutatott készítményt használjuk plazmid klónozó hordozóként. A ptrpED50chGH800 jelű plazmidot (lásd a 4. ábra 108. helyét), amit Martial és munkatársai írtak le [Science, 205, 602-607 (1979)], használjuk a humán növekedési hormon gén egy részét meghatározó szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-f ragmens forrásaként. A fragmenst előállíthatjuk azzal 10 az ismert módszerrel is, amely szerint a humán agyalapi mirigyből mRNS-t izolálunk, amely a humán növekedési hormont határozza meg. Ezt a módszert Goodman és munkatársai írják le [Methods in Enzymology, 68, 75-90 (1979)]. A plrpED50chGH800 jelű plazmid humán növekedési hormon gén-része egyetlen Smal (5’-CCCGGG-3') enzim által felismerhető helyet tartalmaz 6 bázispárral jobbra a gén transzlációs terminációs kodonjától. Ezt a helyet BamHI hellyel cseréltük fel, az alábbiak szerint eljárva: 6 Mg plazmidot 6 egység Smal enzimmel kezelünk 200 m1 alábbi összetételű Smal restrikciós pufferban: 15 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 8,0, 6 mmól magnézium-klorid, 15 mmól kálium-klorid, és 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. A reakciót 1,5 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. Az emésztés teljessé válását követően fenol és kloroform elegyével extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el. A kicsapott dezoxiribonukleinsavat 24 pl TEN-oldatban oldjuk. 40 pikomól foszforilezett BamHI adapter fragmenst (Collaborative Research) adunk 0,5 m1 (0,2) pikomól) fentiekben megadott, emésztett plazmidhoz, 16 pl, 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó ligáz-pufferban. A ligációt 2 órán át 22 C° hőmérsékleten, és ezután 16 órán át 4 C° hőmérsékleten végezzük. A T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz inaktiválására a reakcióelegyet 10 percen át 65 C°' hőmérsékleten tartjuk. Ezután BamHI kohéziv végeket állítunk elő oly módon, hogy 20 egység BamHI enzimet tartalmazó BamHI pufferral 40 pl vég térfogatra hígítjuk az elegyet, és 1 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk. Az enzim hasítja a linker szekvenciát és azt a BamHI helyet is, amely a humán növekedési hormon klónozott cDNS-szekvenciájának kezdetén van. Ily módon 691 bázispárból álló fragmenshez jutunk, amelynek kohéziv BamHI végei vannak. Ezt 6%-os poliakril-amid gélen elkülönítjük, és a távoli hullámhosszúságú ultraibolya fényben vizsgáljuk, miután 1 p/ml töménységű etidium-bromid-oldattal festettük. A fragmenst tartalmazó gélt kivágjuk, és a dezoxiribonukleinsavat egy dialízis zsákba gyűjtjük össze elektroelucióval. Ezután etanolos kicsapást végzünk. A kicsapott dezoxiribonukleinsavat centrifugálással elkülönítjük, TEN-oldatban oldjuk, az oldatot fenol és kloroform elegyével extraháljuk, az etidium-bromid eltávolítására; végül etanollal kicsapjuk. Az elkülönített dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal az előzőekben megadott 20 pl térfogatú ligációs pufferban 0,2 pg pBR322 plaziniddal (lásd a 4. ábra 102. helyét) kapcsoljuk össze. A pBR322 plazmidot előzőleg az egyetlen BamHI helyen hasítottuk, és alkalikus foszfatázzal kezeltük. 16 órán át 4 C° 5 IC 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
