197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
15 197349 16 (150 ramól nátrium-klorid, 20 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 8,0, 10 mmól magnézium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. 100 pl térfogatra hígítjuk, az elegyhez 20 egység BamHI enzimet adunk. 2 órán át 37 C° hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 1%-os agaróz gélen tisztítjuk. A gélt festjük, és a nagyobb fragmenst (4,5 kb) fagyasztás után éluáljuk, és fenol-kloroform-eleggyel tisztítjuk, és etanollal kicsapjuk, a BamHI kohéziv végekkel rendelkező plazmidot 20 pl, 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz pufferban oldjuk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a dezoxi-ribőnukleinsavval E. coli HB101 eejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin (Apr) rezisztenciára szelektáljuk 100 pg/ral antibiotikum jelenlétében, és megvizsgáljuk 10 pg/ml tetraciklinnel szembeni érzékenységüket (Tca). Az ApTc3 fenotípusú telepekből több plazmidot izolálunk az előzőekben megadott Birnboim-módszerrel. Ezeket megvizsgáljuk a Hindin hely hiánya és az egyetlen BamHI hely jelenléte szempontjából. EcoRI és Sáli egymást követő emésztés után 466 és egy 305 bázispárból álló fragmenst kapunk. A második ábra 104. számmal jelölt helyén bemutatott, ezekkel a tulajdonságokkal rendelkező plazmidot szelektálunk, és módosítjuk oly módon, hogy az lpp promotertői balra eső EcoRI helyet eltávolítjuk, és HindlII restrikciós hellyé alakítjuk át. A 2 pg, a 2. ábra 104. helyén bemutatott plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl EcoRI pufferban 0,2 egység EcoRI enzimmel kezelünk 10 percen ét, 37 C° hőmérsékleten. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. Fenol és kloroform elegyével végzett extrakciót kővetően a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, és 200 pl, 1000 egység/ml Sl-nukleázt tartalmazó Sl-nukleáz-pufferban oldjuk. 1 órán át 12 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a reakciót fenol és kloroform elegyével extrahálva leállítjuk, a terméket etanollal kicsapjuk. Ezután 10 pl, 20 pikomól foszforilezett HindlII linkért (5'-CCAAGCTTGG-3’, Collaborative Research) tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázpufferben szuszpendáluk a dezoxi-ribonukleinsavat, és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsavligázt adagolunk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd a ligázt inaktiváljuk oly módon, hogy 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. Ezután 10 egység HindlII enzimet tartalmazó HindlII pufferral 150 pl térfogatúra hígítjuk az elegyet. 2 órán át 37 C° hőmérsékleten tartjuk, majd lX-os agaróz gélen frakcionáljuk. Etidium-bromiddal festjük a gélt, és legnagyobb csíkot (ekvivalens az egy hasítást szenvedett plazmiddal) elkülönítjük és tisztítjuk. A plazmidot 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó 20 pl térfogatú T4 ligáz-puffertan oldjuk. A reakciót 16 órán át 4 C° hőmérsékleten végezzük, és E. coli HB101 sejteket transzformálunk az eleggyel. Az ampicillinre rezisztens transzformánsokat szelektáljuk, és Birnboim-módszerrel vizsgáljuk. A plazmid izolátumokat EcoRI (egy hely) és HindlII (egy hely) restrikciós enzimekkel analizáljuk. Szelektáljuk a 2. ábra 105. számmal jelölt helyén bemutatott, egy EcoRI, HindlII fragmenssel (500 bázispár) jellemezhető plazmidot, és ezt használjuk fel klónozó hordozóként az lpp gén 3’-régiójának kapcsold sához. Két pg, a 3. ábra 105 számmal jelölt helyén bemutatott plazmidot 50 pl Sáli restrikciós pufferban (összetétele a következő: 150 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,9 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmmól fs-merkapto-etanol) 2 egység Sáli enzimmel kezeljük 1 órán át, 37 C° hőmé rsékleten. A reakcióelegyet 2 egység BamHI restrikciós enzimet tartalmazó BamHI-pufferral 150 pl-re hígítjuk. Egy órán át 37 C° hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 2,5 egység alkalikus foszfatázt adagolunk, és 1 órán át 65 C° hőmérsékleten folytatjuk az inkut ációt. Az elegyet fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és a terméket TEN-oldatban oldjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat használjuk az lpp 3’-fregmensének klónozására. Az lpp 3’-régiót tartalmazó fragmens előállítására 10 pg, a 3. ábra 101. számmal jelzet, helyén bemutatott pKENlll plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 200 pl alábbi összetételű Hpal pufferban kezelünk, 10 egység Hpal ;5’-GTTAAC-3’): 20 mmól kálium-klón 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 10 mmól magnézium-klorid és 6 mmól ß-merkapto-etanol literenként, A reakciót 37 C° hőmérsékleten végezzük, 2 órán át. Az elegyet renol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat 10 pl, 20 pikomól foszforilezett Sáli linkért (5’-GGTCGACC-3’, Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-pufferban oldjuk. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd a ligáz inaktiválására 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet. 10 egység Sáli enzimet tartalmazó Sáli pufferral 100 pl térfogatra hígítjuk az elegyet, és 1 órán ét 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 300 pl, 10 egység PvuII restrikciós enzimet tartalmazó, alábbi összetételű PvuII pufferban oldjuk: 60 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 7,5 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. 1 órán át 37 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd dezoxi-ribonukleinsavat 5%-os poliakril-amid gélen frakcionáljuk. 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
