197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
35 197349 36 400 jul Peti (5’-CTGCAG-3’) alábbi összetételű pufferban oldjuk: 50 mmól nátrium-klór id, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 6 mmól magnézium-klorid, és 6 mmól ö-merkapto-etanol, literenként. Az emésztést 50 egység PstI enzimmel végezzük, 2 órán át, 37 C° hómérsékleten. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó, 30 cm hosszú gélen frakcionáljuk, és a szükséges, 46 bázispárból álló szekvenciát tartalmazó, 135 bázispárból álló fragmenst izoláljuk és ismert módon tisztítjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav harmadát (33 Mg plazmiddal ekvivalens menynyiség) Hpall restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük. A dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl alábbi összetételű Hpall pufferban oldjuk: 20 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 7 mmól magnézium-klorid, és 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. A reakciót 1 egység HpaTI enzimmel végezzük, 40 percen át, 37 C° hőmérsékleten. A reakció leállításéra az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 5% akril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk, Egy külön csíkon SauIIIA restrikciós enzimmel emésztett, 1 Mg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat futtatunk. A fragmensek keveréke tartalmaz egy 46 bázispárból álló fragmenst, ezt markerként használjuk. A 135 bázispárból álló fragmens Hpall enzimmel való részleges emésztését követően kapott, 46 bázispárból álló fragmenst (12. ábra 124.) ismert módon tisztítjuk. 0,2 pg, Xbal és PvuII végekkel rendelkező plazmid vektort (12. ábra 127.) 3,2 pikomól, 66 bázispárból álló szintetikus fragmenssel (12. ábra, 128.) és 0,5-1 pikomól, 46 bázispárból álló fragmenssel (12. ábra, 124.) keverünk 10 pl ligációs pufferban. A fragmensek kötését 2 egyseg T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal végezzük, 16 órán át, 4 C° hőmérsékleten. Az eleggyel E. coli JA221 sejteket transzformálunk, és az ampicillin rezisztens telepekből plazmidokat izolálunk. A plazmidokat megvizsgáljuk a 494 bázispárból álló PvuII és a 109 bázispárból álló Xbal, PvuII fragmens jelenlétére. A 12 vizsgált telep egyike tartalmazza ezen fragmenseket. A plazmidot az Xbal helytől a PvuII helyig szekvenciáljuk, és marha növekedési hormonnal szemben radioimmun-méréssel vizsgáljuk. Úgy találtuk, hogy pozitívan reagál a radioimmun-mérés során, és adott szekvenciával rendelkezik. A plazmidot pNM789 jellel jelöljük, és a 12. ábra 129. jellel jelölt részén adjuk meg. Standard radioimmun-méréssel megvizsgáljuk a marha növekedési hormon kvantitatív kifejeződését, és úgy találtuk, hogy sejtenként legalább 105 molekula van jelen. A 13. ábra 129. helyén megadott pNM789 plazmid a marha növekedési hormon teljes kódolására 1 aminosavat meghatározó kodon cseréjét igényli. Ezt úgy végezzük el, hogy a pNM789 28 bázispárból álló PvuII-BamHI fragmensét az alábbi szekvenciájú, és a 13. áb?-a 130. helyén bemutatott szerkezetű, szintetikus kétszálú fragmenssel helyettesítjük (a fragmens a felső szálban 13, az alsó szálban 17 bázispárt tartalmaz): 5’-CTGTGCCTTCTAG-3’ 3’-GACACGGAAGATCCTAG-5’. 10 pg NM789 plazmidot 1 egység PvuII enzimmel kezelünk, 200 m1 PvuII pufferban, 5 percen át, 37 C° hőmérsékleten. Az enzimet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten inaktiváljuk. A mintát 300 pl-re hígítjuk BamHI puffer adagolásával, és 10 egység BamHI enzimmel teljesen emésztjük. Az emésztést 1 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. Ezután 5 egység alkálikus foszfatázt adunk, és 1 órán át 65 C° hőmérsékleten folytatjuk a z inkubá'ást. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen szeparáljuk, és a 13. ábra 131. számmal jelzett helyén megadott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst tisztítjuk. Ez a plazmid egy helyen való hasításkor keletkezik. 0,2 Mg tisztított terméket 5 pikomól szintetikus fragmenssel ligálunk 2 egység T4 ligizzal, 20 m1 ligáz-pufferral készült reakcióelegyben, 1 éjszakán át, 4 C° hőmérsékleten. Transzformációt és az előzőekben ismertetett Bimbóim plazmid izolálását követően több olyan plazmidot szelektálunk, amelyek taitalmazzák a megfelelő PvuII fragmenst (494 bázispár) és Xbal, BamHI fragmenst (628 bázispár). Ezek közül legalább kettőnek a szekvenciáját meghatározzuk a BamHI helytől az egyetlen Smal helyig, majd az adott szekvenciával rendelkező, és a 13. ábra 132. helyén bemutatott egyik plazmidot kiválasztjuk. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás humán vagy bovin növekedési hormon kifejezésére használható rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy összekapcsolunk a) funkcionális replikációs origót tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst; b) egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, amelyek mindegyike megfelelő gazdasejtbe transzformálva az adott vektort, a transzformálható gazdasejtnek szelekcióra alkalmas tulajdonságot biztosít; és c) egy olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, amely tandem elhelyezkedésében az alábbi szekvenciákat hordozza: 1) egy E. coli lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia promotere, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
