197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására

33

197349

34

marha növekedési hormon szekvenciából eredő 494 bázispárból álló PvuII f ragmens egyetlen asszimetrikus Smal restrikciós helyet tartalmaz. A kiindulási pNM702 szülőplazmid Smal helyet nem tartalmaz. A 494 bá- 5 zispárból álló PvuII fragmenst és 440 bázispárból álló Xbal, Smal fragmenst tartalmazó plazmidot köztes plazmidként izoláljuk, és felhasználjuk a további kísérletekben.

A 12. ábra 126. helyén megadott köztes 10 plazmidot átalakítjuk a fuzionált marha növekedési hormont kifejeződő plazmiddá. Két módon végezzük a kísérletet:

1) Az enterokináz szubsztrát-humán növekedési hormon első 30 aminosavát meghatáro- 15 zó kódoló szekvenciát eltávolítjuk, és helyettesítjük az enterokináz szubsztrát-marha növekedési hormon első 31 aminosavát meghatározó szekvenciával, és

2) A stop kodonig terjedő kódoló szekven- 20 ciában lévő második PvuII hely egy rövid szekvenciáját (ez humán növekedési hormon szekvencia) egy szintetikus fragmenssel helyettesítjük, annak érdekében, hogy helyreállítsuk a marha növekedési hormon 190. ami- 25 nosavának, az alaninnak a kodonját.

10 Mg 12. ábra 126. helyén megadott köztes plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 1 egység PvuII enzimmel hasítunk 200 m1 PvuII pufferban. A reakciót 5 percen át végezzük, 30 37 C° hőmérsékleten. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten

tartjuk. A fragmensek keverékét tartalmazó elegyet IX agarózt tartalmazó gélen szeparáljuk, és a molekulánként csak egy PvuII hasítási helyet tartalmazó lineáris plazmidot izoláljuk és tisztítjuk. A 3 Mg terméket 5 egység Xbal enzimmel teljesen emésztjük és alkalikus foszfatázzal kezeljük. A fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen frakcionéljuk, és a legnagyobb fragmenst (ez nem tartalmazza az Xbal és az első PvuII hely között a humán és marha növekedési hormon szekvenciában lévő 109 bázispárból álló részt) izoláljuk, és felhasználjuk klónozó vektorként (12. ábra, 127.).

A marha növekedési hormon első 23 aminosavát meghatározó, 69 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia az első PvuII helyig két Hpall restrikciós enzimmel hasítható helyet (5’-CCGG-3’) tartalmaz. Az első hely 23 bázispárnyi távolságra van a kódoló szekvencia első nukleotidjától. Foszfo-triészter-inódszerrel 63 bázispárból álló fragmenst szintetizálunk (12. ábra, 128.). Ez a fragmens megfelel az lpp riboszóma kötőhelyében lévő Xbal hely ATG iniciációs kodonig terjedő, 19 bázispárból álló szekvenciának, amit a Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 24 bázispárból álló kódoló szekvencia és 20 olyan nukleotid követ, amely a marha növekedési hormon szekvenciájával azonos a Phe helytől az első Hpall helyig terjedően.

A fragmens az alábbi szerkezetű:

Xbal

5-CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAG- 3’- TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCHpall

TTCCCAGCCATGTCCTTGTC 3’ AAGGGTCGGTACAGGAACAGGC 5*

A 63 bázispárból álló fragmens előállítására az alábbi szegmenseket állítjuk elő:

45

1) CTAGAGGGTAT

2) TAATAATGTTC C

3) CATTGGATGAT

4) GATGATAAGTTCC

5) CAGCCATGTCCTTGTC 50

6) ATGGGAACATTATTAATACCCT

7) TTATCATCATCATCCA

8) ATGGCTGGGAAC

9) CGGACAAGGAC.

55

A fenti szegmenseket felhasználva T4 ligázzal katalizált reakciókat végzünk, az alábbi sorrendben:

a) Az 1. 5’-nem-foszforilezett szegmenst 5’-foszforilezett 6. szegmens jelenlétében go hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 2. szegmenssel T4 ligáz katalizálta reakcióban, amiután megkapjuk az 1. duplexet. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk. @5

b) A 3., 4. és 5. 5’-foszforilezett szegmenseket 5'-foszforilezett 7. és 8., továbbá 5’nem-foszforilezett 9. szegmens jelenlétében T4 ligázzal kapcsoljuk, amiután megkapjuk a 2. dezoxi-ribonukleinsav-duplexeket. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

c) Az 1. és 2. uuplexeket T4 ligázzal öszszekapcsoljuk, amiután megkapjuk a 12. ábra 128. dezoxi-ribonukleinsav-duplexét, ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. A dezoxi-ribonukleinsavduplexet T4 polinukleotid-kinázzal és (gamma-p32)ATP-vel ismert módon enzimatikusan foszforilezzük.

A fentiekben megadott Hpall helytől a PvuII helyig terjedő, 46 bázipárból álló dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst az eredeti pBP348 plazmidból állítjuk elő. 100 Mg plazmidot 400 pl PvuII pufferban 50 egység PvuII enzimmel kezelünk, 2 órán át, 37 C° hőmérsékleten. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavat

18