197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
31 197349 32 vétóén úgy találtuk, hogy 12 plazmid tartalmazza a várt 628 bázispárból álló fragmenst. A pozitív plazmidok közül nyolcat Xbal és ezután PvuII enzimmel kezelünk, hét egy 109 bázispárból álló fragmenst adott. Az egyik plazmid szekvenciáját Maxam és Gilbert módszerével megállapítottuk [Proc. Natl. Sei., USA, 74, 506-564 (1977)], és azt pontosnak találtuk. A plazmidot pNM702 jellel jelöljük, és a 10. ábra 123 helyén ismertetjük. A humán növekedési hormon kifejezését standard radioimmun-méréssel határozzuk meg [Twomey és munkatársai, Clin. Chem., 20, 389-391 (1974)]. A kvantitatív kifejeződés-vizsgálat szerint sejtenként legalább 2 millió molekula keletkezik. 500 g E. coli sejtből részelegesen tisztítjuk a Met-phe-pro-leu-(asp)4-lys-humán növekedési hormont, oly módon, hogy 8 mólos karbamiddal és 1% Triton X100-zal extrahálunk. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk, és az oldódó humán növekedési hormont tartalmazó felülúszót Whatman DE52 oszlopon frakcionáljuk. A radioimmun-méréssel meghatározott aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és izoelektromos kicsapást végzünk. A terméket Whatman SE53 oszlopon tovább tisztítjuk. A frakciók közül a terméket tartalmazókat radioimmun-méréssel kiválasztjuk, és a terméket izoelektromos kicsapással vagy ultraszűréssel töményítjük. A részlegesen tisztított terméket enterokináz enzimmel hasítjuk. A Miles Laboratories nyers sertés enterokinázát Anderson és munkatársai módszerével [Biochemistry, 16, 3354-3360 (1977)] tovább tisztítjuk. Az enterokinázt a szubsztráttal együtt inkubáljuk, és időközönként mintákat veszünk, amelyeket izoelektromos fókuszáló gélen vizsgálunk. A kiindulási anyag izoelektromos pontja 4,3, ez az idővel változik, végül eléri a humán növekedési hormon 4,91 izoelektromos pontját. 5. példa A Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-marha növekedési hormont kifejező plazmid előállítása E. coli lipoprotein promoter felhasználásával A 11. ábra 123. helyén bemutatott pNM702 plazmid a humán növekedési hormont kifejező plazmid. Kiindulási anyagként ezt használjuk fel a Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-marha növekedési hormont kifejező plazmid előállítására. A Miller és munkatársai által leírt [J. Biol. Chem., 255, 7521-7524 (1980)] és a 11. ábra 124. helyén bemutatott pBP348 plazmidot használjuk fel a marha növekedési hormon gén egy részét meghatározó szekvenciát hordozó két dezoxiribonukleinsav-fragmenst forrásként. A plazmid a pBR322 PstI (5'-CTGCAG-3’) restrikciós helyébe építve tartalmazza a 831 bázispárból álló és a marha, növekedési hormont meghatározó szekvenciát. Miller és munkatársai módszere helyett előállíthatjuk a marha növekedési hormon szekvenciáját a marha agyalapi mirigyből ismert módon izolált mRNS-ből is [Goodman és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 75-90 (1979)]. Ahogy az előzőekben már említettük, a humán növekedési hormon és marha növekedési hormon kódoló szekvenciája igen hasonló, és sok homológiát mutat. A PvuII (5-CAGCTG-3’) restrikciós enzimmel kapót fragmensek felhasználhatók a marha növekedési hormont kifejező plazmid előállítására. Molekulánként 3 PvuII helyet tartalmazó pNM702 (11. ábra 123.) dezoxi-ribonukleinsav IC Mg-nyi mennyiségét egy egység PvuII enzimmel hasítunk, 200 pl alábbi összetételű PvuII restrikciós pufferban, 10 percen át, 37 C° hőmérsékleten: 60 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,5, 6 mmól magnézium-klorid, és 6 mmól /5-merkapto-etanol, literenként. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk, és a dezcxi-ribonukleinsavat alkalikus foszfatázzal kezeljük. A részleges emésztés során a PvuII jelenlévő helyeinek fele-kétharmada hasad. A fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen szeparáljuk, és a 11. ábra 125. számmal jelzett helyén megadott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (valamivel gyorsabban mozdul el, mint az egy hasítást szenvedett plazmid) kihasítjuk a gélből. Ez a fragraens 497 bázispárból álló PvuII fragmenst nem tartalmazó lineáris plazmid nak felel meg. A tisztított terméket vektorként használjuk a 11. ábra 126. helyén megadott köztes plazmid előállítására. A pBP348 plazmidból előállítunk egy 494 bázispárból álló PvuII fragmenst. 10 jug plazmidot 200 ni PvuII pufferban emésztünk 10 egység PvuII enzimmel, 1 órán át, 37 C° hőmérsékleten. A fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen szeparáljuk, és a 494 bázispárból álló fragmenst (11. ábra 124.) megfigyeljük, és az előzőekben megadottak szerint tisztítjuk. Ezután előállítjuk a 11. ábra 126. helyén megadott köztes plazmidot oly módon, hogy 0,2 Mg vektort és 0,05 Mg, 494 bázispárból álló fragmenst összekapcsolunk 20 Mg T4 dezcxi-ribonukleinsav-ligáz pufferban, amelyhez 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk. A reakciót 16 órán át végezzük 4 C° hőmérsékleten. Transzformációt és a transzformánsok ampicillin rezisztenciára való szelektálását követően plazmidokat izolálunk az előzőekben megadott Birnboim-módszerrel, és megvizsgáljuk a 494 bázispárból álló PvuII fragmens jelenlétét. A fragmens megfelelő orientációját Xbal és Smal enzimekkel való egymást követő emésztéssel bizonyítjuk. A 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
