197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására

29

197349

30

start kodonnal kezdődő humán növekedési hormont kódoló szakaszt, és amiután egy, az enterokináz által felismert és hasított szekvenciát meghatározó rövid peptidet leíró kódoló szakasz következik. A felső szál 90 5 nukleotidból áll, ez az 5’-végén Xbal hasítást követően kapott 4 nukleotidból álló egyszálú részt hordoz. Az alsó szál olyan 86 nukleotidból áll, amely komplementer a felső szál utolsó 86 nukleotidjával. A szintetikus ,10 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens első részét

az lpp gén természetes szekvenciája követi, a riboszóma kötőhely Xbal restrikciós helyétől a 19 bázispárból álló transzlációs iniciációs metionin kodonig, majd ezután következik az enterokináz hasitási helynek megfelelő szekvencia, és a humán növekedési hormon első 47 nukleotidja az előzőekben megadott egyetlen PnuDII helyig.

A 10. ábra 122 helyén megadott kétszálú dezoxiribonukleinsav-fragmens az alábbi szerkezetű:

Xbal

5’ CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAATCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTTFnuDII

CCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG 3’ GGTAAGGGAATAGGTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC 5’

A fragmenst az ismert foszfo-triészter- 20 -módszerrel állítjuk elő, az alábbi szegmensekből:

1)

CTAGAGGGTAT

25

2)

TAATAATGTTCC

3)

CATTGGATGAT

4)

GATGATAAGTTCC

5)

CAACCATTCCC

6)

TTATCCAGGC

7)

TTTTTGACAACG

30

8)

CTATGCTCCG

9)

CATTATTAATACCCT

10)

ATGGGAA

11)

CTTATCATCATCCA

12)

GGTTGGGAA

35

13)

GGATAAGGGAAT

14)

GTCAAAAAGCCT

15)

CGGAGCATAGCGTT.

A fenti szegmenseket

használva T4 li- 40

gázzal sorrendben elvégezzük az alábbi kötő-reakciókat:

a) Az 1. 5’-nem-foszforilezett szegmenst hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 2. szegmenshez B’-foszforilezett 9. szeg- 45 mens jelenlétében T4 ligázzal, amiután megkapjuk az 1. dezoxi-ribonukleinsavduplexet (Brown és munkatársai, Methods in Enzymology, 68, 109-151, 1979).

A duplexet preparatív gélelektroforézis- 50 sei izoláljuk 15%-os poliakril-amidon.

b) Az 5’-foszforilezett 3. szegmenst 5’-foszforilezett 11. szegmens jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 4. szegmenshez, amikor meg- 55 kapjuk a 2. dezoxi-ribonukleinsav-duplexet, amit 15%-os poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.

c) Az B’-foszforilezett 5. szegmenst 5’- 60-foszforilezett 12. és 13. szegmensek jelenlétében T4 ligázzal hozzákapcsoljuk

az 5’-foszforilezett 5. szegmenshez, amikor megkapjuk a 3. dezoxi-ribonukleinsav-duplexet, amit 15%-os poliakril- 65-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.

d) Az 5’-foszforilezett 7. szegmenst 5’-foszforilezett 14. és 5’-nem-foszforilezett 15. szegmens jelenlétében hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 8. szegmenshez T4 ligázzal, amikor megkapjuk a 4. dezoxi-ribonuklemsav-duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.

e) Ezután a 2., 3. és 4. dezoxi-ribonukleinsav-duplexeket T4 ligázzal 5. dezoxi-ribonukleinsav-duplexszé kapcsoljuk őszsze, a terméket 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk.

f) Az 1. dezoxi-ribonukleinsav-duplexhez T4 ligáz jelenlétében hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 10. szegmenst, és az 5. dezoxi-ribonukleinsav-duplexet, a kapott és a 10. ábra 110. helyén bemutatott dezoxi-ribonukleinsav-duplexet ezután 10% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. Ezt a dezoxi-ribonukleinsav-duplexet T4 polinukleotid-kináz és (gamma-p32)ATP jelenlétében ismert módszerrel enzimatikusan foszforilezzük.

A kifejeződő plazmid előállítására enzimatikusan összekapcsoljuk 0,1 pikomól (0,4 ug) plazmid vektort (5. ábra 107.), 0,025 pikomól szintetikus dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (5. ábra 110.) és 0,3 pikomól (0,08 Mg) 538 bázispárból álló fragmenst (10. ábra 109., lásd az előzőekben). A reakciót 24 Mg ligációs pufferban végezzük 1.5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd az előzőekben megadottak szerint eljárva E. coli JA221 sejteket transzformálunk. A transzformált telepeket 100 Mg/ml ampicillint tartalmazó agar-lemezeken szelektáljuk. 19 telepből izoláljuk Bimbóim módszerével (lásd előbb) a plazmidokat. Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel való emésztést és akrilamid gélelektroforézist kö-16