197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
27 197349 28 szenvedett, a 8. ábra 119. helyén megadott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. 0.2 Mg fragmenst 5 pikomól szintetikus fragmenssel ligálunk 2 egység T4 ligáz jelenlétében, 20 jul ligáz-pufferban, 1 éjszakán át, 4 C° hőmérsékleten. Transzformációt és az előzőekben ismertetett Bimbóim plazmid izolálását követően több olyan plazmidot szelektálunk, amely tartalmazza a megfelelő nagyságú PvuII fragmenst (494 bázispár), és Xbal, BamHI fragmenst (604 bázispár). Legalább két termék szekvenciáját a BamHI helytől az egyetlen Smal helyig meghatározzuk, és egyet kiválasztunk, amelynek megfelelő a szekvenciája. Ezt a 8. ábra 120. számmal jelzett helyén mutatjuk be. 3. példa Az 1. példában megadottak szerint előállított plazmid variációja. A pNM645 (9. ábra 111.) plazmid tetraciklin-rezisztenciát biztositó variációját állítjuk elő oly módon, hogy a BamHI és Sáli restrikciós helyek között lévő lpp 3’-szekvenciát a pBR322 (9. ábra 102.) plazmidból származó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenssel cseréljük ki. A pBR322 plazmidban a tetraciklin-rezisztencia egy olyan gén által biztosított, amelynek promoterét HindlII enzimmel (5’-AAGCTT-3’) hasíthatjuk. A gén kódoló szakasza ennek közelében kezdődik, és a plazmid BamHI és Sáli restrikciós helyéig tart. A tetraciklin promotert HindlII emésztéssel és SÍ nukleázos kezeléssel roncsoljuk oly módon, hogy az egyszálú végeket eltávolítjuk. 5 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység HindlII enzimmel kezelünk 1 órán ét, 37 C° hőmérsékleten, az alábbi összetételű, 200 m1 HindlII pufferban: 60 mmól nátrium-klorid, 20 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 10 mmól magnézium-klorid és 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. A dezoxi-ribonukleinsavat ezután fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 300 pl SÍ pufferban szuszpendáljuk. A puffer összetétele a következő: 300 mmól nátrium-klorid, 25 mmól nátrium-acetét, pH = 4,25, 1 mmól cink-klorid, literenként. Az SÍ nukleázt 1000 egység/ml koncentrációban adagoljuk, és az elegyet 1 órán át 15 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A terméket fenol és kloroform elegyével extraháljuk, és az etanollal kicsapott dezoxi-ribonukleinsavat 200 m1 alábbi összetételű Sáli restrikciós pufferban oldjuk: 150 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH * = 7,9, 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. Az emésztést 5 egység Sáli enzimmel végezzük, 1 órán át, 37 C° hőmérsékleten. Az elegyet 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel frakcionáljuk, és izoláljuk a keletkezett 617 bázispérból álló fragmenst. A frag mens tisztítását az előzőekben megadottak szerint végezzük. 5 Mg pNM645 dezoxi-ribonukleinsavat 5 egység BaMHI enzimmel kezelünk, 1 órán át, 37 C° hőmérsékleten. A terméket fenol és kloroform elegyével extrahálj uk, és etanollal kicsapjuk, majd dezoxiribcnukleinsavat TEN-oldatban oldjuk. 2 Mg, BamHI kohézív végekkel rendelkező pNM645 dezoxi-ribonukleinsavat tompa végű dezoxi-ribonukleinsavvá alakítunk oly módon, hogy 1 egység E. coli dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz I enzim nagy fragmensével feltöltjük. A faltöltést 20 m1 alábbi összetételű dezoxiribonukleinsav-polimeráz I pufferban végezzük' 70 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,6, 10 mmól magnézium-klorid, 10 mmól ß-merkapto-etanol és 0,5-0,5 mmól dATP, dCTP, dGTP és dTTP, literenként. A reakciót 1 órán át végezzük 15 C° hőmérsékleten. Az enzimet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten denaturáljuk, és dezoxiribonukleinsavat Sail puffer és 3 egység Salr restrikciós enzim adagolásával hasítjuk. Az emésztést 1 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. A dezoxi-ribonukleinsavat IX agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk, és a nagy plazmid fragmenst fagyasztást követően eluáljuk a gélről. Az etidium-bromidot és az agaróz fragmenseket fenol és kloroform elegyével extrahálva eltávolítjuk és etanolos kicsapást végzünk. A plazmidot 20 m1 TEN-oldatban oldjuk. 0,2 Mg (0,05 pikomól) plazmid vei tort 0,2 Mg (0,05 pikomól) 617 bázispárból álló fragmenshez ligálunk, az előzőekben megadott körülmények között. Az eleggyel E. coli JA221 telepeket transzformálunk, és 100 Mg/ml ampicillint és 15 Mg/ml tetraciklint tartalmazó agar-lemezeken szelektálunk. Izoláljuk a 9. ábra 121 helyén megadott pNM736 jellel jelzett plazmidokat, ezek a restrikciós enzim analízis szerint az adott szekvenciát tartalmazzák. A metionil-humán növekedési hormon kifejezése a pNM645 plazmidnál találttal azonos. 4. példa A Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-humán növekedési hormont kifejező plazmid előállítása és felhasználása szubsztrátként szelektív enterokináz (3. 4. 21. 9) hasításra érett humán növekedési hormon előállítására. Foszfo-triészter-módszerrel szintetizálunk egy kétszálú, a 10. ábra 122. számmal jelzett helyén megadott dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst, és hozzákapcsoljuk egy olyan lpp promoter régióhoz, amely megelőzi a 15 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
