197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
25 197349 26 A 42 bázispárból álló fragmens előállítására az alábbi hat szegmenst állítjuk elő: 1) CTAGAGGGTAT 2) TAATAATGGCTTTTC 3) CGGCTATGTCTCTGTC 4) CATTATTAATACCCT 5) TAGCCGGAAAAGC 6) CGGACAGAGACA. A fentiek szerint előállított szegmenseket használva, az 5’-foszforilezett 2. szegmenst, az 5’-foszforilezett 3. szegmenst, az 5’-foszforilezett 5. szegmenst és a hat 5’nem-foszforilezett szegmenst, T4 ligázzal öszszekapcsoljuk, amiután egy duplexet kapunk. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. A duplexhez hozzákapcsoljuk az 5’-nem foszforilezett 1. szegmenst, és az 5’-foszforilezett 4. szegmenst T4 ligázzal. A 7. ábra 116. helyén megadott és a fentiek szerint előállított 42 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-duplexet 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve tisztítjuk. A duplexet ezután 5’-végein T4 polinukleotid-kinázt és (gamma-p32) ATP-t használva enzimatikusan foszforilezzük, ismert módszerek szerint eljárva. A pBP348 eredeti plazmidból előállítjuk a fentiekben megadott Hpall helytől a PvuII helyig terjedő 46 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst. 100 /ug plazmidot 400 pl PvuII pufferban 50 egység PvuII enzimmel kezelünk, 2 órán át, 37 C° hőmérsékleten. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavat 400 ul PstI (5’-CTGCAG-3') pufferban oldjuk. A puffer összetétele a következő: 50 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmól /3-merkapto-etanol, literenként. Az oldott terméket 50 egység PstI enzimmel kezeljük, 2 órán át, 37 C° hőmérsékleten. 6% poliakril-amidot tartalmazó, 30 cm hosszú gélen szeparáljuk, a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket, és az adott 46 bázispárból álló szekvenciát tartalmazó, 135 bázispárból álló fragmenst izoláljuk, és ismert módszerrel tisztítjuk. A kapott, 33 pg plazmiddal ekvivalens dezoxi-ribonukleinsav 1/3 részét Hpall restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük. A dezoxiribonukleinsav emésztését 100 /ul Hpall pufferban végezzük, amelynek összetétele a következő: 20 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, 7 mmól magnézium-klorid, és 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. Az emésztést 1 egység Hpall enzimmel végezzük, 37 C° hőmérsékleten, 40 percen át. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 5% akril-amidot tartalmazó gélen futtatjuk. Egy kü- 14 lönálló csikón 1 pg SauIIIA restrikciós enzimmel emésztett pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat elektroforetizálunk. A fragmensek elegye egy 46 bázispárból álló fragmenst tartalmaz, ezt markerként használjuk. A 46 bázispárból álló fragmens a 135 bázispárból álló fragmens Hpall részleges emésztésekor keletkezik (ez utóbbit a 7. ábra 112. helyén adjuk meg). A fragmenst ismert módszerekkel tisztítjuk. A 7. ábra 115. helyén megadott, XBal és PvuII végekkel rendelkező, 0,2 pg plazmid vektort 1,6 pikomól szintetikus, 42 bázispárból álló és a 7. ábra 116. számmal jelölt helyén megadott fragmenssel elegyítünk, majd az elegyhez hozzáadunk a 7. ábra 112. helyén megadott 0,5-1 pikomól, 46 bázispárból álló fragmenst. A 10 pl térfogatú ligációs pufferben 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal végezzük a ligációs reakciót, 16 órán át, 4 C° hőmérsékleten. Az eleggyel E. coli JA221 sejteket transzformálunk, és a plazmidokat az ampicillin-rezisztens telepekből izoláljuk. A plazmidokat megvizsgáljuk a 494 bázispárból álló PvuII és a 88 bázispárból álló Xbal, PvuII fragmens jelenlétére. A 36 analizált telep közül 18 rendelkezik ezekkel a fragmensekkel. Két plazmidot szekvenálunk az Xbal helytől a PvuII helyig, és radioimmun-méréssel teszteljük marha növekedési hormonra. Az egyik a radioimmun-mérés során pozitív eredményt adott, és a megfelelő szekvenciával rendelkezik. Ezt a plazmidot a 7. ábra 117. helyén adjuk meg, és pNM797 jellel jelöljük. Standard radioimmun-méréssel mérjük a kvatitativ kifejeződést, és úgy találjuk, hogy sejtenként legalább 105 molekula marha növekedési hormon van jelen. A 8. ábra 117. helyén megadott pNM797 plazmid egy aminosav kodon cseréjét igényli a marha növekedési hormon teljes kódolása érdekében. A cserét úgy végezzük, hogy pNM797 fragmens PvuII-től a BamHI helyig terjedő, 28 bázispárból álló fragmensét kihasítjuk, és az alábbi, és a 8. ábra 118. helyén megadott szintetikus kétszálú fragmenssel helyettesítjük (a felső szálon 13, az alsó szálon 17 bázispárt tartalmaz): 5’ CTGTGCCTTCTAG 3’ 3’ GACACGGAAGATCCTAG 5’. 10 pg pNM797 dezoxi-ribonukleinsavat 1 egység PvuII enzimmel kezelünk, 200 pl PvuII pufferban, 5 percen ót, 37 C° hőmérsékleten. Az enzim inaktiválására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A mintákat BamHI pufferral 300 pl-re hígítjuk, és 10 egység BamHI enzimmel 1 órán át 37 C° hőmérsékleten teljesen emésztjük. Ezután 5 egység alkalikus foszfatázt adagolunk, és 1 órán át 65 C° hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el, és tisztítjuk az egyetlen vágást 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65
