197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
23 197349 24 esetén. A megfelelő restrikciós helyek mindkét szekvenciában azonos kódoló helyen helyezkednek el. Molekulánként 3 PvuII helyet tartalmazó, 10 pg, a 6. ábra 111. helyén megadott 5 pNM645 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat egy egység PvuII enzimmel kezelünk, 200 pl alábbi összetételű PvuII restrikciós pufferral készült reakcióelegyben: 60 mmól nátrium-klorid 10 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,5 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmól <3-merkapto-etanol, literenként. A reakciót 10 percen át 37 C° hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására az 15 elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk, majd dezoxi-ribonukleinsavat alkalikus foszfatázzal kezeljük. Ez a limitált emésztés a jelenlévő PvuII helyek felének-kétharmadának a hasadásához vezet. A 20 fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen szeparáljuk, és a 6. ábra 113. számmal jelzett helyén bemutatott, a 497 bázispárból álló PvuII fragmenst elveszett lineáris plazmidnak megfelelő dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst 25 (valamivel gyorsabban mozdul el, mint az egyetlen hasadást szenvedett plazmid) kivágjuk a gélből, tisztítjuk és a köztes pNM685 plazmid előállítására vektorként használjuk fel (a plazmidot a 6. ábra 114. helyén mutat- gq juk be). A pBP348 plazmidból előállítunk egy 494 bázispárból álló PvuII fragmenst. 10 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 200 pl PvuII pufferban 10 egység PvuII enzimmel keze- 35 lünk, 1 órán át, 37 C° hőmérsékleten. A fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen különítjük el, és a 494 bázispárból álló fragmenst (6. ábra 112.) előzőekben megadott módszereket használva tisztítjuk. Előállítjuk a 6. ábra 114. számmal jelzett helyén megadott köztes pNM685 plazmidot oly módon, hogy 0,2 pg 113 jelű vektort 0,05 pg, 494 bázispárból álló fragmenssel ligálunk 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz 45 pufferban, amelyhez 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk. A reakciót 16 órán át végezzük 4 C° hőmérsékleten. Transzformációt és az ampicillinre rezisztens transzformán6ok szelekcióját követően plaz- gQ midokat izolálunk az előzőekben megadott Birnboim-módszert használva. A plazmidokat megvizsgáljuk a 494 bázispárból álló PvuII fragmens jelenlétére. Az Xbal és az Smal enzimekkel végzett egymást követő emésztés- 55 sei meghatározzuk a fragmens megfelelő orientációját. A marha növekedési hormon szekvencia 494 bázispárból álló PvuII fragmense egyetlen aszszimetrikus Smal restrikció helyet tartalmaz. A pNM645 szülŐplazmid Smal helyet nem tartalmaz. Köztes plazmidként kiválasztunk egy 494 bázispárból álló PvuII fragmenst, és egy 416 bázispárból álló Xbal, SmaT fragmenst tartalmazó plazmidot. A 7. ábra 114. helyén bemutatott pNM685 plazmidot az alábbiak szerint eljárva átalakítjuk marha növekedési hormont kifejezn' képes plazmiddá: Úgy járunk el, hogy 1) a humán növekedési hormon első 22 aminosavját meghatározó szekvenciát eltávolítjuk, és kicseréljük a marha növekedési hormon első 23 aminosavát meghatározó szekvenciára, és 2) a második PvuII hely és a stop kodon közötti rövid szekvenciát (ez humán növekedési hormon szekvencia) kicseréljük egy olyan szintetikus fragmenssel, amely visszaállítja az alanin kodont, azaz megadja a marha növekedési hormon 190. aminosavának kodonját. 10 pg pNM685 plazmidot egy egység Pvul enzimmel kezelünk 200 pl PvuII pufferban. A reakciót 5 percen át végezzük 37 C° hőmérsékleten. A reakció leállítására az elegyet 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. A fragmensek keverékét IX agarózt tarta’inazó gélen frakcíonáljuk, és a molekulánként csak egyetlen PvuII hasítási helyet tartalmazó lineáris plazmidot izoláljuk és tisztítjuk. Az elkülönített 3 pg-nyi mennyiségű anyagot 5 egység Xbal enzimmel teljesen emésztjük, és alkalikus foszfatázzal kezeljük. A fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen frakcíonáljuk, és a legnagyobb fragmenst elkülön'tjük és klónozó vektorként használjuk fel. A 7. ábra 115. számmal jelzett helyén megadott termék az Xbal hely és a humán és marha növekedési hormon első PvuII helye között lévő, 85 bázispárból álló fragmenst elvesztette. A marha növekedési hormon első 23 aminosavát (69 bázispár) reprezentáló dezoxiribom kleinsav-szekvencia az első PvuII helyig két Hpall restrikciós enzim által felismerhető helyet tartalmaz (5’-CCGG-3’). Az első hely 23 bázispárnyi távolságban van a kódoló szekvencia első nukleotidjától. A foszfotriészter-módszert használva szintézissel előállítunk egy olyan, 42 bázispárból álló fragmenst, amelyet a 7. ábra 116. helyén mutatunk be, és amely megfelel annak a 19 bázispárból álló szekvenciának, amely az lpp riboszóma kötőhelyen lévő Xbal helytől az ATG iniciációs kodonig terjed, és amelyet a marha növekedési hormon első 23 bázispárból álló szekvenciája követ. A fragmens az alábbi szerkezetű: Xbal Hpall 5’-CTAGAGGGTATTAATAATGGCTTTTCCGGCTATGTCTCTGTC-3’ 3’ TCCCATAATTATTACCGAAAAGGCCGATACAGAGACAGGC 5’ 13
