197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
3 197349 4 Á találmány protein termékek előállítására használható új dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák és klónozó vektorok (hordozók) előállítására vonatkozik. Inouye Masayori és munkatársai kiterjedt vizsgálatokat végeztek a Gram-negativ baktériumok külső membrán proteinjeit, elsősorban a lipoproteint meghatározó gének megismerésére. A vizsgálatok bizonyították, hogy a lipoproteinek viszonylag nagy menynyiBégben vannak jelen a baktérium sejtekben. így például az Escherichia coli külső membránjában sejtenként 7,2 x 105 lipoprotein molekula van. Ezen felül, mivel úgy tűnik, hogy az E. coli kromoszómában csak egyetlen lipoprotein strukturgén létezik, transzkripciójának módja igen hatékony kell legyen. Inouye és munkatársainak a közelmúltban végzett kísérletei arra irányultak, hogy a lipoproteint olyan megfelelően elkészített plazmiddal fejezzék ki, amelyet megfelelően transzformált mikroorganizmusokba juttattak, és amely kísérletek lehetővé teszik a különböző lipoprotein gének (Ipp) meghatározását és dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáinak analízisét. Nakamura és Inouye közlik [Cell, 18, 1109-1117 (1979)] az E. coli külső membrán lipoprotein jé nek dezoxi- ribonukle insav- s zekvenciáját. Ezen szekvencia promoter szakaszának analízise bizonyos érdekességeket mutatott. ElŐBZÖr is úgy találták, hogy a transzkripciós iniciációs helyet (-1-től a -261. bázispárig) megelőző 261 bázispár adenin-timin-tartalma 70%, azaz igen magas a 322 bázispárból álló mRNS szakasz 53%-os a transzkripciós terminációs hely után következő 127 bázispárból álló szegmens 44%-os, és az E. coli kromoszóma átlagos, 49%-os adenin-timin-tartalmához képest. Másodszor, úgy találták, hogy a transzkripciós iniciációs helytől balra eső első 45 bázispár (-1-től a -45. bázispárig) 36 olyan bázist tartalmaz, amely vagy adenin vagy timin (80%). Harmadszor, a transzkripciós iniciációs helytől 8 bázissal eltolódva egy a Pribnow-boxszal azonos heptanukleotid-szekvencia helyezkedik el; negyedszer, a -27. és a -39. bázispárok között mindkét szálon egy RNS polimeráz felismerő hellyel analóg szekvencia található, ötödször, a transzkripciós iniciációs helynél egy hosszú szimmetrikus szakasz található. Inouye és munkatársai kijelentették, hogy ezek a tulajdonságok külön-külőn vagy egymással kombinálódva felelősek az lpp promoter nagyfokú hatékonyságáért. Részletesebben szólva, úgy találták, hogy a promoter-szekvencia magas adenin-timin-tartalma destabilizálja a dezoxi-ribonukleinsav hélix-szerkezetét, és ezzel a transzkripció kezdetéhez létfontosságú szálkicsavarodást elősegíti. Inouye csoportja továbbá kimutatta, hogy nagyfokú homológia áll fenn a lipoprotein génszekvenciák között, valószínűleg az összes Gram-negatív festődésű baktérium esetén. így a Serratia marcescens lipoprotein gén dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciájának összehasonlítása az E. coli lpp génjével nagyfokú homológiát mutatott [Nakamura és Inouye, Proc, Natl. Acad. Sei., USA, 77, 1369- -1373 (1980)]. Kimutatták, hogy különösen nagyfokú az azonosság a promoter .régióban (84%-os homológia), ennek extrém magas adenin- és timin-tartalma (78%) összehasonlítható az E. coli-éval (80%). Ugyanakkor, a lipoprotein mRNS 5'-nem-transzlatált szakasza is nagy homológiát (95%) mutat. Újabban Yamagata és munkatársai [J. Biol. Chem., 256, 2194-2198 (1981)] analizálták az Erwinia amylovora lipoprotein génjeinek dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját, és öszszehasonlították az E, coli és E. marcescens génjével. Ezek a vizsgálatok szintén alátámasztják az lpp gének között fennálló nagyfokú homológiát. A promoter régió (-45-től a -1-ig) igen hasonló, 87% a homológia az E. coli-hoz és 93% az S. marcescens-hez viszonyítva. Igen magas adenin- és timin-tartalmat mutattak ki (80%), ez gyakorlatilag azonos az E. coli-éhoz (80%) és az S. marcescens-éhez (78%). Az mRNS nem-transzlatált szakaszénak szekvenciája 97%-os homológiát mutat az E. coli-éval és 92%-os homológiát az S. marcescens-ével összehasonlítva. Az Inouye által bizonyított tény, hogy a lipoprotein gén nagyfokú konstitutív transzkripciót szenved, azt jelzi, hogy ez alkalmas idegen dezoxi-ribonukleinsav-fragraensek kifejezésére. Inouye és munkatársainak munkája továbbá azt látszik bizonyítani, hogy a Gram-negatív festődésű baktériumok, például az Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Klebsiella aerogenes, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda, Erwinia amylovora, Serratia marcescens lipoprotein génjei is felhasználhatók. Inouye és munkatársainak kísérletei nemrég bizonyították, hogy a lipoprotein gén alkalmas termék kifejezésére [Lee, Nakamura és Inouye, J. Bacter., 146, 861-866 (1981)]. E munka során az S. marcescens lipoprotein génjét, lambda fág-vektorba klónozták, és ezután reklónozták a pBR322 és pSCIOl plazmid vektorokba. Az S. marcescens lpp gént hordozó mindkét vektorral E. coli sejteket transzformáltak. A kísérleti tények szerint normális kifejeződés történt, bár az E. coli lpp gént hordozó vektorokhoz képest valamivel kisebb mértékben. Akárhogy is, az irodalomban közlik, hogy az lpp gén promotert és 5’-nem-transzlatált régiókat tartalmazó vektorok felhasználhatók jelentős mértékű lipoprotein-kifeje zésére. A leírás során vektor alatt plazmidot, fág dezoxi-ribonukleinsavat vagy más, olyan dezoxi) ibonukleinsav-szekvenciát értünk, amely 1) egy gazdasejtben replikálódni képes; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
