197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
5 197349 6 2) egy gazdasejtet transzformálni képes; és 3) a transzformált sejtek azonosítására használható markert hordoz. A találmány szerinti eljárás klónozó vektorok specifikus osztályának két változatára vonatkozik. Külső proteinek jelentősen megnővekedett kifejeződése érhető el a klónozó vektorok bármelyik kiviteli változatával. Az első kiviteli változat szerint a klónozó vektorokat úgy készítjük el, hogy tandem elhelyezkedésben tartalmazzanak egy, a lipoprotein promoter régiót meghatározó nukleotid-szekvenciát, a lipoprotein 5’-nem-transzlatált szakaszát meghatározó nukleotid szekvenciát, és egy olyan szekvenciát, amely egy külső eredetű protein terméket határoz meg. Az ilyen terméket meghatározó szekvenciát egy transzlációs startjelet reprezentáló kodonon át kötjük a lipoprotein gén 5’-nem-transzlatált szakaszának 3'-végéhez. A második kivitelezési változat szerint az idegen eredetű protein terméket meghatározó szekvenciát az előzőekben megadott start kodonon és egy enterokináz hasítási helyet meghatározó nukleotid-szekvencián át kapcsoljuk a lipoprotein gén 5'-nem-transzlatált szakaszának 3’-végéhez. A találmány tárgya eljárás humán vagy bovin növekedési hormon kifejezésére használható rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok előállítására. Az alábbiakat tartalmazó klónozó vektort állítjuk elő: a) E. coliban funkcionális replikációs origót tartalmazó dezoxi- ribonukleinsav-szegmens; b) egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav-szegmens, mindegyik egy olyan tulajdonságot juttat transzformálható E. coli sejtbe transzformációkor, amely szelekcióra használható; és c) tandem elhelyezkedő, alábbiakat tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-szegmen8: 1) egy lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia promotere, 2) egy lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia 5'-nem-transzlatált szakasza, és 3) egy transzlációs start kodon, és ezután egy külső proteint meghatározó szekvencia, a kettő között a sejt saját proteinjét meghatározó nukleotid-8zekvencia sem egy része, sem egésze nem lehet, vagy a transzlációs start kodon után egy enterokináz hasítási helyet meghatározó nukleotid-szekvencia helyezkedik el, ehhez megszakítás nélkül egy külső eredetű proteint leíró nukleotid-szekvencia kapcsolódik. A dezoxi-ribonukleinsav klónozó rekobináns vektor előállítására az a), b) és c) pont dezoxi-ribonukleinsav-szegmenseket összekapcsoljuk. Ahogy azt mér közöltük, a találmány célja olyan dezoxi-ribonukleinsav- 4-szekvenciák és rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok előállítása, amelyek igen nagy hatékonysággal termelik a külső eredetű proteint. Mindegyikükben szerepel legalább egy lipoprotein gén (lpp) rendszer, és E. coliból származó lipoprotein gén. Külső eredetű protein alatt olyan protein terméket értünk, amely a lipoprotein gén-rendszer által kifejezett lipoprotein molekulától, vagy bármilyen ehhez hasonló molekularésztől különbözik. Az lpp gént öt elemmel írhatjuk le. Abban a sorrendben, ahogy a génben szerepelnek, ezek a következők: 1) a promoter régió; 2) az 5'-nem-transzlutált szakasz; 3) a lipoproteint kódoló szekvencia; 4) a 3'-nem-transzlatáll szakasz; és 5) transzkripciós terminációs hely. Ezen elemek funkciója a gén-rendszerben jól ismert. A promoter régió szabályozza az mRNS-termelés kezdetét (transzkripció). A promoter mentes lehet külső szabályozástól (konstitutív), állhat egy represszor szabályozása alatt, amely utóbbi - ha jelen van - leállítja a gén funkcióját. Állhat továbbá egy inducer szabályozása alatt; ez az inducer olyan anyag, amely a génfunkciót megindítja. Az lpp gén nem áll külső szabályozás alatt, ezért konstitutív. A promoter közelében, vagy a promoterben helyezkedik el a transzkripciós iniciációshely, ez az a pont, ahová a ribonukleinsav polimeráz kötődik, és ahol elkezdődik az mRNS-transzkripciója. Ha egyszer a transzkripció megindult, mRNS keletkezik. Az mRNS szerkezetét a génelemek közül a második-negyedik határozza meg. A keletkező mRNS protein termékké fordítható szekvenciát hordoz. A transzlatálható szekvencia az 5’-nem-transzlatált szakasztól jobbra, a 3’-nem-transzlatált régiótól pedig balra helyezkedik el. A transzlációt a ríboszómáknak az mRNS molekulán lévő 5'-nemtranszlatált szakaszon lévő szekvenciához való kötődése szabályozza, ez a riboszóma kötőhely és egy transzlációs start kodonnal (AUG) kezdődik, amely egyébként kódolja a metionin (Met) amino6avat is. A transzláció a transzlatált szakasz végén elhelyezkedő egy vagy több termináciÓ6 kodonnál áll le. A rekombináns dezoxi-ribonukléinsav technikákkal lehetséges olyan klónozó vektorok előállítása, amelyek felhasználhatók kül3Ö eredetű (idegen) proteinek előállítására oly módon, hogy a vektorokba kifejezést szabályozó szekvenciákat építünk be, azaz olyan nukleotid-szekvenciát, amely szabályozza az adott strukturgénhez kapcsolódva annak kifejeződését. A találmány szerinti eljárás során előállított klónozó vektorok az lpp kifejeződést szabályozó szekvenciát vagy annak egy részét tartalmazzák, azaz hordozzák az előzőekben ismertetett 1), 2), 4) és 5) elemeket. A négy elem közül a találmány szerinti klónozó vektorban csak az 1. és 2. elemek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
