197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
197 047 52 pBR(AP)/LylFN-a-3 plazmid előállításához hasonlóan. Az új plazmid tartalmazza a CG-pBR 322/HlyclFN-5, beépített DNS-szakaszt, és a CG- pBR(AP)/LylFN-a-l-ből származó ß-laktamäz szabályozó szakaszt. Az E. coli HE 101 CG- pBR(AP)/LyIFN-a-2 kldnt izoláljuk. A klón interferon-aktivitása 50 000 nemzetközi egyság/ml; ez az eredeti E. coli HB 101 CG-pBE 322/ HÍyclFN-5l sejthez képest ötszörös növekedést jelent. A CG-pBR(AP)/LyIFN-a 2 plazmid cDNS beépített szakaszának és a ß-laktamäz szabályozó szakasz nukleotid szekvenciáját meghatározzuk, az előbbiek szerint eljárva. A vizsgálat eredményét a 13. ábrán adjuk meg. ■ Ói 8. példa Az £. colt HB 101 CG-pBR(AP)LyIFN-<x-3 tenyésztése fermentorban Az E. coli HB 101 CG-p8E(AP)/LylFN-a-3 törzset a X je hl táptalajon tenyésztjük. A táptalaj az alábbi összetételű: dinátríum-hidrogén-foszfát. 7 víz 13,25 g kálium-dibidrogén-foszfát 0,3 % nátrium- kloríd 0,05% aminőnium-klorid 0,1% kalcium-klorid . 2 víz 0,0015% magnézium-szulfát. 7 víz 0,025% vas-(HI) citrál 0,0006% kazaminsav 1,80% élesztőkivonat 0,2% glükóz 0,87ó tetracikiin 0,001%. A glükózt hővel, a íetraciklint pedig szűréssel külön sterilezzük. Háromszor 2 1, egyenként 500 ml fenti összetételű táptalajt tartalmazó lombikot oldunk ferdeagaron jól növekvő sejtekkel. A tenyészeteket percenként 120-at forduló, körkörös kitérésű rázóasztalon tenyésztjük, 30 JC hőmérsékleten, 11 órán át. 1,5 1 inökulummal 500 i-es fermentorban sterilezett, 300 1 térfogatú X-jelű táptalajt oltunk. A tenyésztést az alábbi körülmények között végezzük: keverés: 350—500 fordulat/perc (Flat blade keverő), a tenyészeten 0,3—1,0 térfogat/perc levegőt vezetünk át, a fermentorban 0,3 bar túlnyomást biztosítunk, és 30 °C hőmérsékletet. A táptalajban levő oldott oxigén koncentrációját 50%-os telítési érték alá nem hagyjuk esni, adott esetben növeljük a levegőztetés mértékét, vagy adott esetben a keverést, A táptalaj pH-ját 6,8-on tartjuk oly módon, hogy szabályozott mértékben nátrium-hidroxidot adagolunk. 10 órás tenyésztést követően a tenyészetben mérhető a legmagasabb interferon titer (ezt Armstrong 129/ szerint határozzuk meg), ekkor összegyűjtjük a sejteket. 9. példa A HLylFN-ix -3 izolálása és tisztítása a) Polipeptid-oldat előállítása moncklőnozott antitestből álló oszlop készítésére 280 I, 7,2 pH-jú tenyészlevet 10 ‘C-ra hűtünk, és a sejteket Álfa-Laval BRPX-207 szeparátorra! szeparáljuk. A tiszta felülúszó interferon-aktivitást nem tartalmaz. A sejtek összegyűjtése előtt a szeparátorban összegyűlt folyadékot 20 I iízis-puffer A-val helyettesítjük. Ennek összetétele a következő: 50 mM trisz-hidrogén-klorid, 50 mM etilén - diamin - tetraecetsav, 0,2 M nátrium - klorid, 10 n\M feni! - metil - szulfonil - fluorid, 1 mM L-cisztein, pH — 8,2 (hidrogén-kloriddal beállítva). Ezután elengedjük a centrifuga-részben összegyűlt 7 l folyadékot. Háromszor 2 1 lízis-puffer A-val mo sunk. A kapott sejtíömeg térfogatát a pufferra! 20 Ere egészítjük ki, ekkor a pH 6,9. A szusznenziőt 5—10 “C hőmérsékletre hűtjük, és DYNÜR-malmon (KDL-Pilot, 1,41) engedjük át, az eszközön poliuretán keverőiap van. Az eszközben 1170 ml, 0,5—0,75 mm átmérőjű üveggyöngyöket helyezünk, és a keverő fordulatszámáí percenkénti 3350-re állítjuk be. A szuszpenziót 5 1/óra sebességgel vezetjük át a malmon, így a sejtek roncsolódnak. A kapott szuszpenzióhoz 800 ml további 100 g polietilérr-imint tartalmazó, és hidrogén-kloriddal 8,2 pl-I-ra beállított hzis-puffer A-t adunk, és az így kapott, feltárt sejtszuszpenziót 2 °C hőmérsékleten enyhén keverjük. A szuszpenzió pH-ja 7,6, 3 órán át —2 'C hőmérsékleten tartjuk és centrifugáljuk. A 17,2 1 térfogatú felütúszóhoz 3028 g ammónium-szulfátot adunk. Az enyhén zavaros elegyet 1 órán át 6 °C hőmérsékleten hagyjuk állni, rnajd centrifugáljuk. A felülúszót 4324 g ammónium-szulfáttal kezeljük, és egy éjszakán áí állni hagyjuk. Ezután percenkénti 3000 fordulatszámmal centrifugálunk. A centrifugálás után kapott nedves maradékot (1224 g) puffer-B-ben oidjuk. Ennek összetétele a következő: 25 mmól trisz-hidrogén-kiorid, 10 pmoS feni! - metil - szulfonil - fluorid, pH — 8,5 (hidrogén-kloriddal beállítva). így 2,8 I az előállítandó polipeptidet tartalmazó oldatot kapunk. • 700 ml poiipeptid-oidatot szobahőmérsékleten H1P10 Hollow szűrőpatronon diafiltrálunk 7 1 puffer-B-t használva, Arnicon DC-2 Hollow Fibre System segítségével. A szűrőpatront puffer-B-vel mossuk, a diaííitrált oldatot és a mosófolyadékokat egyesítjük, majd az így kapott 1440 ml térfogatú oldatot 200 mi/óra sebességű áramlással DEAE- oszlojxm (TrisacrylR M DEAE, LKB 2205-300) vezetjük át, a gyantaágy térfogata 450 ml, és puffer-B-vel egyenlítettük ki. A 280 nm hullámhoszszon UV-abszorpciót mutató első poiipepcid frakciót kiöntjük. Fuffer-B-vel tovább mossuk az oszlopot, mindaddig, míg legalább ötszörös gyantaágy-térfogatnyi mosófolyadéknak nlap-abszorpciója van 280 nra-en. Ezután 2,8 1 pufíer-C-vel eluáljuk a polipeptidet. A puffer összetétele a következő: 0,2 M nátrium-klorid, 25 mM trisz-hidrogén-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 27
