197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
53 1S7 047 54 klorid, pH — 8,5. Az oszlop-kromatográfiát 4 °C hőmérsékleten végezzük. Az eluátumok interferonaktivitása Armstrong (29) szerint mérve 1,4X105 nemzetközi egység/mg polipeptid. Az eluátum pH-ját 2 mólos hidrogén-klorid-oldattal 7,4-re állítjuk be, és 100 ml térfogatú aliquotokat -—20 °C hőmérsékleten fagyasztunk mindaddig, míg felhasználjuk a monoklónozott antitesteket tartalmazó oszlop-kromatográfiához. b) A humán LyIFN-o. -3 tisztítása monoklónozott antitesteket tartalmazó oszlopon A monoklónozott antitesteket tartalmazó oszlopot (1K2-20) foszfát-puffért tartalmazó sóoldattal egyenlítjük ki. Az oszlop térfogata 0,8 ml (lásd alább). A puffer-oldat összetétele a következő: 0,137 M nátrium-klorid, 0,0027 M káíium-klorid, 0,0077 M dinálrium - hidrogén - foszfát. 12 víz, 0,0015 M kálium - dihidrogén - foszfát, pH = 7,4 Az oszlopra szobahőmérsékleten 10 ml-nyi menynyiségű, fentiek szerint előállított polipeptid-oldatot juttatunk 10 ml/óra sebességgel. Az első frakciók a nem-adszorpciós polipeptideket tartalmazzák, és a 3 ml térfogatú PBS mosófolyadékot ezzel együtt elöntjük. A további, nem-specifikusan kötődő polipeptideket 3 ml, további 0,5 M nátríumkloridot és 0,2% Triton-X-100-at tartalmazó PBS- oldattal eluáljuk. Az oszlopot 3 ml PBS-oldattal mossuk, ezután a specifikusan adszorbeálódott polipeptideket 3 ml puffer D-vel eluáljuk. A D-puffer összetétele a következő: 0,1 M citromsav, 0,3 M nátrium-klorid, pH — 2. Ezt a frakciót és az ezt követő 4 ml-nyi PBS mosót egyesítjük, az oldat pH-ját 2 n nátrium-hidroxid-oldattal 6,3-re állítjuk be, és 4 *C hőmérsékleten, CXTM molekuláris szeparátorral (MilliporeR) tízszeresére töményítjük. A sűrítményt Sephadex G-25 (fine) oszlopra öntjük, az oszlop 200 ml térfogatú, és 2,6 X 34 cm méretű. Az oszlopot 0,025 M hisztidin . hidrogén - klorid - oldattal 6,3 pH-n egyensúlyozzuk ki. A terméket a fenti hisztidin - hidrogén - klorid (pH — 6,3) oldattal eluáljuk, 4 *C hőmérsékleten, 42 ml/óra sebességgel. 10,5 ml térfogatú, 20 frakciót gyűjtünk. A polipeptidet tartalmazó frakciókat a 280 nm-en mért abszorpció alapján választjuk ki. A 7. és 8. frakciók interferon-aktivitású polipeptidet tartalmaznak, a mérést Armstrong (29) szerint végezzük. Az LylFN-a-3 terméket tartalmazó aktív frakciókat —20 *C hőmérsékleten, vagy jégfürdőben tároljuk, további felhasználásig. A frakciók interferon-aktivitása 1,8X10* nemzetközi egység/mg polipeptid. . A fenti frakciókat fagyasztva szárítva 1 ml oldatból 20—20 pg polipeptidet kapunk. ■ A kapott LylFN-a-3 molekulasúlya az SDS-poliakrilamid gélelektroforézises (lásd 49) mérés szerint ISkDalton. A tiszta, aktív, humán LylFN-a-3 izoelektromos pontja ultravékony poliakrilamid gélrétegen végzett izoelektromos fókuszálás (100 pmól, Radola, lásd 50) szerint 4,5 és 6,5 közötti pH-n mérve: 5,3— 5,4. -c) Az 1K2-20 monoklónozott antitest oszlop előállítása A) Az egerek immunizálása Balb/c egereket (8 hetes, a Tierfarm Sysseln, Svájc eladóitól) 3 X105 egység, 1 % tisztaságú, humán leukocita IFN-a-val oltunk be, komplett Freund-adjuváns (Difco) segítségével, a négy talpon keresztül. A 30. napon inkomplett Freund-adjuvánssal hasonló mennyiségű interferont oltunk be, azonos helyen. A 3. injekciót a 85. napon adagoljuk, ekkor sóoldatban intraperítoneálisan 4X105 egység humán leukocita interferont adagolunk. 4 nappal később a lépeket fúzióra eltávolftjuk. B) A hibrhlómdk előállítása A fúziós kísérletekhez X-63-Ag8-653 myelomavonalat (52) használunk Köhler és Milstein (53) szerint eljárva. 10* lépsejtet 107 myelomasejttel keverünk, 1 ml, 50%-os polietilén-glikolt (PEG 1500, Serva) használva (54). Mosást követően 48 ml standard Duibecco minimál táptalajban (Gibco) szuszpendáljuk a sejteket. Töltősejtként 15% borjúszérumot és fúzióként 3 X lö6 normál egér peritoneális sejtet adagolunk. A sejteket 48X1 ml Costar-csövecskében osztjuk el. A tenyészeteket hetente kétszer standard, szelektív táptalajjal (53) töltjük fel, 3-6 héten át. Amikor a hibridek növekszenek, lefagyasztjuk azokat, és a felülúszókat antiinterferon-aktivitásra métjük. A hibridómasejtek klónozását mikrotiíer lemezeken, limitált hígítással végezzük.. C) Antitest-mérés A felülúszó anti-interferon aktivitásának mérésére 50 pl IFN-a-t (végkoncentráció 10-20 egység interferon/ml) inkubálunk, 50 pl feiülúszóval, szobahőmérséleten. 30-60 perccel később a maradék interferon-aktivitást standard interferon méréssel visszamérjük. Ez a módszer azonban csak konvencionális antitestek mérésekor biztosít jó eredményt, esetünkben vagy téves, vagy nem reprodukálható eredményeket ad a hibridóma felülúszö esetén. Ezért az alábbi, kombinált immunprecipitációs biomérést használtuk. 50 pl nyers IFN-a-t (104 egység/ml) azonos mennyiségű feiülúszóval keverünk Eppendorf 3810 mikrocsőben. Keverést követően 37 °C hőmérsékleten inkubálunk, 2-4 órán át. Ezután 50 pl, előzőleg titrált nyúl anti-egér lg antitestet (Nordic) adagolunk, és az elegyet először 37 °C hőmérsékleten 1 órán át, majd ezután 16 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk, az immunkomplexek kialakítására. Ezután 5 percen át hideg szobában, 12 000 másodpercenkénti fordulatszámú centrifu‘ ga-rotorban centrifugálunk. A felülúszót megőrizzük, és a csapadékot egyszer 1 ml pufferezett sóoldattal (pH — 7,2) mossuk. Mosást követően a csapadékot 200 pl sóoldatban (pH — 2,2) oldjuk. Az oldatok interferon-aktivitását Armstrong (29) szerint méijük. 5 10 15 20 25 30 35 4C 45 50 55 60 65 28
