197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
49 197047 50 klón interferon-specifikus protein-hozamát az alábbiak szerint növeljük (lásd a 11. ábrát): a) A ß -laktamáz szabályozó szakaszt tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-fragmens előállítása a CG-pBR(AP)/LylFN-a- 1-ből A CG-pBR(AP)/LyIFN-a-l 100 pg-tiyi dezoxi-ribonukleinsavát Hind III (Biolabs.) és Bgl If (Biolabs.) restrikciós enzimekkel hasítjuk. Fenollal extraháljuk az oldatot, majd etanollal kicsapjuk, és a hasított dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst szacharóz sűrűségi gradiens centrifugálissal (5-23%) izoláljuk 50 niM trisz-hidrogén-klorid (pH =< 8,0) és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavban. A centrífugálást TST 60 rotorban végezzük (Kontron AG), percenkénti 58 000 fordulatszámmal, 15 *C hőmérsékleten, 4 órán át. 0,2 ml térfogatú frakciókat szedünk, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A kis fragmenst (Hind III-Bgl II) tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal ismert módon kicsapjuk. A csapadékot 80 pl, 10 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH ■=* 7,5) és 0,05 mM etilén - diamin - tetraecetsavat tartalmazó elegyben oldjuk. Az optikai sűrűségi mérés szerint 16 pg dezoxi-ribonukleinsavat kapunk. ■ 4 pg Hind III-Bgl II dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst Sau 3A (Biolabs.) enzimmel hasítunk, és a hasított termékeket 6% poliakrilamidot tartalmazó gélen frakcionáljuk, trisz - borát - etilén - diamin - tetraecetsav - elegyben. A dezoxi-ribonukleinsavfragmenseket etidium - bromiddal festjük (0,5 pg/ ml festékanyag). A 239 bázispárbó! álló Hind IIISaU 3A dezoxi-ribonukleinsav-íragmenst az előzőekben megadottak szerint extraháljuk és izoláljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat etanollal ismert módon kicsapjuk. A csapadékot 20 pl, 10 mM trisz - hidrogén - kloridot (pH = 7,5) és 0,05 mM etilén - diamin - tetraecetsavat tartalmazó elegyben újra oldjuk. -b) A cDNS beépített szakasz előállítása A rekombináns CG-pBR 322/HLycIFN-S’, plazmidban levő cDNS beépített szakaszt az előzőekben megadottak szerint (7a/ példa) eljárva Pst 1 restrikciós endonukleázzal kihasítjuk. . 2 pg kihasított cDNS-t 2,5 egység Sau 3A (Biolabs.) enzimmel hasítunk, 10 pg/ml etidium-bromid jelenlétében. A reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük, 60 percen át. Az emésztett terméket fenollal extraháljuk, és az oldatban maradt dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 1,2% agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk, 50 mM triszt, 50 mM bórsavat, 1 mM etilén - diamin - tetraecetsavat és 0,5 pg/ml etidium -bromidot tartalmazó elegyben. Az Sau 3A-Pst I 396 bázispárból áltó második legnagyobb fragmenst extraháljuk a gélről, és a 7a) példában megadottak szerint tisztítjuk. A dezoxiribonukleinsavat 20 pl, 10 mM trisz - hidrogén - kloridot (pH = 7,5) és 0,05 mM etilén - diamin - tetraecetsavat tartalmazó elegyben újra oldjuk. c) A Hind lll-Sau 3A dezoxi -ribonukleinsa v-fragmens ligálása a cDNS beépített szakaszhoz (Sau 3A -Pst I) 50 ng dezoxi-ribonukleínsav-fragmenst mindkét termékből elegyítünk, és az alábbi összetételű oldatban inkubáljuk, 3 órán át, 15 "C hőmérsékleten: 10 mM magnézium-klond, 10 mM ditio-treitol, 0,5 mM ATP és 30 egység/pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz (Biolabs.), Az elegyet 15 percen át 80 'C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 50 mM nátrium-klorid végtérfogatot állítunk be, 0,5 egység Pst I (Biolabs.) és 1 egység llind III (Biolabs.) enzimmel emésztjük a dezoxi-ribonukleínsav keveréket. A reakciót 20 percen át végezzük 37 °C hőmérsékleten. Fenollal extraháljuk az oldatot, majd a dezoxi-ribonukieinsavat etanollal kicsapjuk, és 20 pl, 10 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH **■ 7,5) és 0,05 mM etilén - diamin - tetraecetsavat tartalmazó elegyben oldjuk. . A kapott elegy egyik felét a pBR 322 plazmid nagy Hmd Ill-Pst I dezoxí-ribonukleinsav-fragmenséhez (100 ng) ligáljuk, 10 mM magnéziumkloridot, 10 mM ditio-trietolt, 0,5 mM ATP-t és 30 egység/pl T4 dezoxí-ribonukleinsav-ligázt (Biolabs.) tartalmazó reakcióelegyben. A reakciót 15 ”C hőmérsékleten végezzük, 2 órán át. Így olyan oldatot kapunk, amely tartalmazza a CG- pBR(AP)/LyIFN-a-3 rekembináns plazmidot. d) Az E. coli HB 101 transzformálása a CG-pBR(AP)/LyIFN-a.-3plazmiddal A. fentiek szerint előállított oldat 1/10-éve) a 4. példában megadottak szerint eljárva transzformáljuk az E. coli HB 101 sejteket. A transzformált telepek IFN aktivitását az előzőekben (6. példa) megadott módon vizsgáljuk. A legnagyobb mennyiségű interferon-aktivitást szintetizáló kiónt kiválasztjuk, és E. coli HB 101 €G~pBR(AP)/LyJFN-a-3-nak nevezzük el. Az interferon-aktivitást az előzőekben (6. példa) megadottak szerint határozzuk meg. 70 000 nemzetközi egység/ml aktivitást találtunk, ez az eredeti E. coli HB 101 CG-pBR 322/HlycIFN~8,1 klón eredeti aktivitásához képest 700-szoros növekedést jelent. . A CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 klón rekombináns plazmid dezoxi-ribonukleinsavát izoláljuk a tenyészetből Az izolálást az előzőekben, a 3c) példában megadottak szerint végezzük. A terméket a cDNS beépített szakasz (interferon gén) nukleotid-szekvenciájának és a ß-laktamäz szabályozó szakasz szekvenciájának meghatározásával jellemezzük. Az eredményeket a 12. ábrán adjuk meg. A CG-pBR (AP)/LyIFN-a-3 plazmid előállításakor használt módszereket felhasználhatjuk az ’összes (x-interferon cDNS gének előállítására, vagy a megfelelően hasított kromoszómális a-interferon gének kialakítására. Például úgy járunk el, hogy a CG-pBR 322/ IlLyicIFN-5j plazmidbóí kiindulva előállítjuk a CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 plazmidot a CG-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65 26
