197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
43 197 047 44 és a 368 bázispárból álló Pvu H*-Bgl II dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (B-próba) 8% poliakrilamidot tartalmazó gélről izoláljuk az 5d) példában megadottak szerint eljárva. A terméket in situ telephibridizációhoz használjuk (lásd alább). A plazmid dezoxi ribonukleinsavak hasítását, a jelzést és a dezoxi-ribonukleínsav-fragmensek tisztítását az előzőekben, az 5d) példában megadottak szerint végezzük. • A 4. példában megadottak szerint előállított 4000 transzformáns telepet BA 85 nitrocellulóz szülőre (Schleicher és Schuell, 8 cm átmérő) juttatjuk. A sejteket lizáijnk és dezoxi-ribonukleinsavtartalmukat denaturáljuk, majd in situ fixáljuk a szőrökre. Ezt Grunstein és Hogness (36) szerint végezzük. Az A- és B-próbák (a próbákat összekeverjük) hibridizálását az előzőekben, az, 5c) példában megadottak szerint végezzük. Autoradiográfíával 6 pozitív telepet különböztethetünk meg, ezek közül hármat az alábbiak szerint jelzünk: • E. coli HB 101 CG-pBR 322/'HLyclFN-4„ E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycJFN-5,, és E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLyclFN-8’,. Ezeket használjuk a további vizsgálatokhoz. A kiónok plazmid dezoxi-ribonukleinsavát izoláljuk, újratranszformálunk vele, és az 5c) példában, illetve az 5d) példában megadottak szerint újra izoláljuk a dezoxi-ribonukleinsavat. . A rekombináns dezoxi-ribonukleinsavak természetének vizsgálatára a cDNS beépített szakasz részleges vagy teljes nukleotid-szekvenciáját az előzőekben (5d/ példa) megadottak szerint megállapítjuk. Részletesen szólva, úgy járunk el, hogy 5 pg izolált CG-pBR 322/HLycIFN-4, és CG-pBR 322/ HLycIFN-8’, piazmid dezoxi-ribonukleinsavat Pvu II enzimmel emésztünk, 5’-terminálisan jelzünk és Pst I enzimmel hasítunk A fragmenseket 8% poliakriíamidot tartalmazó gélen frakcionáljuk, és a 8’, DNS-ből a 120 bázispárból álló Pst I-Pvu II* fragmeast és a 4i-dezoxi-ribonukleinsavbói a S2 bázispárból álló Pst 1 Pvu II* fragmenst a fentiek szerint izoláljuk. A CG-pBR 322/HLycIFN-5, izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavát az alábbiak szerint kezeljük: • Egyrészről 5 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat* Hae III enzimmel emésztünk, 5’-terniiná!isan jelzünk és Pst I enzimmel hasítunk. Az 57 bázispárból álló Pst I-Hae 111* dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst 10% poliakrilamidot tartalmazó gélen izoláljuk. Másrészről 5 pg plazmidot EcoR í enzimmel emésztünk, S’-terminálisan jelzünk és Pst I enzimmel hasítunk. A 235 bázispárból álló Pst I-EcoR 1* és a körülbelül 700 bázispárból álló EcoR I*-Pst I dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 8% poliakrilamidot tartalmazó gélen izoláljuk. A különböző dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket Maxam és Gilbert (41) módszere szerint szekvenáljuk. • A cDNS beépített szakasz nukíeotid-szekvenciáját a 6-8. ábrán adjuk meg. A 6. ábrán a CG-pBR 322/HLyclFN-4, beépített cDNS nukleotid-szekvenciáját mutatjuk be. A beépített szakasz az 5’végen 23 dezoxi-guanozin-csoporttal folytatódik, és részben tartalmazza az IFN-az (Le) cDNS-t, amit Streuli és munkatársai írnak le (12). A 3’extracisztronos régióban kis változások (pontmutációk) láthatók, és egy 318 nukleotidból álló további szakasz. A 7. ábrán mutatjuk be a CG-pBR 322/HLycIFN-8’, nukleotid-szekvenciáját. A beépített szakasz az S’-végen 20-23 dezoxi-guanozincsoportot tartalmaz, és hasonlít, de nem azonos a Coeddeí és munkatársai (14), továbbá Mantei és munkatársai (11) által leírt IFN-a (D-típus) cDNS-sel. Az 1FN kódoló szekvenciát megelőző és követő cDNS régiókban felfedezhető különbségeken túlmenően az 1FN gén a 28-30. pozícióban CCC-tripletet és a 409-411. pozícióban egy GCG- tripletet tartalmaz, amely alanint határoz meg a GTC és GTG valint meghatározó szekvencia helyett. Végül a 8. ábrán látjuk a CG-pBR 322/ HLycIFN-5, beépített cDNS szakasz nukleotidscekvenciáját, amely az 5’-végen 17 - dezoxi - guarozin - csoportot tartalmaz. A nukleotid-szekvencia hasonló a Goeddel és munkatársai (14) által leid IFN-a (B-típus) cDNS-szekvenciához. Ugyanakkor további nukleotidokat találunk a HLycIFN- 5, beépített cDNS 5’-végének nukleotidjai között, l-ontmutációkat, kihasadt és beépített részeket az t xtracisztronális régióban, de megtaláljuk az IFN-t meghatározó szekvenciát, különösen látható ez a 22 és 361-372 pozíciókban. 6. példa A humán interferonok szintézise humán IFN-specifikus rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekulákat tartalmazó E. colival Az alábbi öt klón tartalmaz humán interferon specifikus rekombináns dezoxi-ribonukleinsav motdcIllát * E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l’b, E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-4„ E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLyclFN 5,, E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-ß’1( és E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLyclFN-ßt. A törzsek interferon aktivitását meghatározzuk, a meghatározást a2 alábbiak szerint végezzük: A megfelelő E. coli kiónok 30 ml-nyi tenyészetét tripton-tántalajban állítjuk elő, a növesztést addig végezzük, míg az ODej0.-en mért optikai sűrűség 1 lesz. A sejteket összegyűjtjük, és 0,5 ml, 30 mM nátrium-kloridot és 50 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH = 8,0) tartalmazó vizes oldatban szuszpendáljuk. Ezután 1 mg/ml lizozimot (Sigma) adagolunk. 30 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd folyékony nitrogénben fagyasztjuk, 37 °C hőmérsékleten felolvasztjuk, ezt ötször ismételjük. Ezután 20 percen át percenként 20 00U-et forduló centrifugában (Sorvall SS 34 rotorban) centrifugáljuk 4 *C hőmérsékleten. A fetüluszó interferon aktivitását citopatikus bioméréssel határozzuk még Armstrong (29) szerint, ahogy azt az 1c) példában megadtuk. A következő aktivitásokat mértük: 5 1 f\ 15 20 30 35 40 45 50 55 60 65 23
