197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
45 i 97 04/ Az extraktum forrása interferon-aktivitás A rekombináns dezoxi-ribonukieinsavat tartalmazó E. coli HB 101 (Nemzetközi egység/ ml) CG-pBR 322/HLycIFN- l’b 0;0 CG-pBR 322/HLyclFN-41 0;0 CG-pBR 322/HLyclFN-51 10 000;10 000 CG-pBR 322/HLycIFN-8,1 100;100 CG-pBR 322/HLycIFN-fl( 0;0 Azok a kiónok, amelyek mérhető interferon aktivitást nem mutatnak, valószínűleg olyan rekombináns dezoxi-ribomikleinsavat tartalmaznak, amelyben a HuLyIFN-cDNS beépített szakasz a transzkripció szempontjából alkalmatlan orientációban helyezkedik el. így egy ilyen klón, nevezetesen a CG- pBR 322/HLycIFN-l’b klón rekombináns dezoxiribonukleinsavát (teljes hosszúságú cDNS beépített szakasszal) az alábbiak szerint újra orientáljuk: Az E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLyciFN-l’b klón plazmid dezoxi-ribonukleinsavát az 5c) példában megadottak szerint eljárva izoláljuk, és Pst 1 enzimmel hasítjuk. 0,5 ug hasított dezoxi-ríbonukleinsavat 20 pl, 20 mM trisz-bidrogén-klorid (pH = 7,8), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM ditiotreitol, 25 mM nátrium-klorid és 50 pg/ml zselatin-tartalmú pufféiban oldunk, és 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-iigázzal (Bioiabs.) kezelünk. A kezelést 0,5 mmól ATP jelenlétében 2 órán át végezzük, 15 °C hőmérsékleten. A kapott cDNS eleggyel a 4. példában megadottak szerint eljárva E. coli HB 101 sejteket transzformálunk. A transzformált telepeket Mc Conkey-agaron szelektáljuk, a szelekciót tetraciklin jelenlétében végezzük- Ezután nitrocelluíóz szűrőkre replikázzuk a telepeket. Négy baktériumtelep hibridizálodik a CC-pBR 322/HLycIFN-l’b rekombináns dezoxi-ribonukleinsav (lásd 5e/ példa) P1í-jelzett Pvu II-Bgl II* 351 bázispárból álló íragmenséhez. Ezeket E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLyclFN-l’b,- i’b4-ig jelöljük. A négy klón extraktumát a fentiek szerint állítjuk elő, és meghatározzuk interferon aktivitásukat. Az alábbi aktivitásokat mértük: Az extraktum forrása Interferon-aktivitás A reko/nbináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó E. coli HB 101 (Nemzetközi egység/ CG-pBR ml) 322/1 ILyclFN-l’b, 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-l’b2 0;0 CG-pBR 322/HLydFN-l’b, ü;ü CG-pBR 322/HLycIFN-l’b4 30;30 A CG-pBR 322/HLyclFN-l’b4 olyan cDNS beépített szakaszt tartalmaz, amely képes interferonaktivitással rendelkező polipeptid szintézisének meghatározására. -4c 7, példa Nagy mennyiségű, interferon-aktivitással rendelkező polipeptidek szintézisét meghatározó rekombináns piazmidok előállítása, és E. coli HB 101 sejtek transzformálása a plazmidokka! A) A CG-pBR (AP)ZLylFN-a-l rekombináns plazmid előállítása Az E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLyclFN-í’b kión interferon-specifikus fehérjéjének termelésfokozására a 9. ábrán sematikusan ábrázolt kísérletet végezzük el. . a) A cDNS beépítendő szakasz előállítása Az E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-i’b klón rekombináns plazmid dezoxi-ribonukíeinsavának 150 pgnyi mennyiségét standard reakciókörülmények között (lásd 5d/ példa) Pst I (Bioiabs.) enzimmel hasítunk. Fenokrs extrakciót és etanolos kicsapást követően a kihasadt szakaszt szacharóz sűrűségi gradiens centsifugálássai (5- 23% szacharóz) izoláljuk 50 mM írisz-hidrogénkioridot (pH = 8,0) és 1 mM etilén-diaxnin-tetraecetsavat tartalmazó oldatban. A centrifugálást 1ST 41 rotorban (Kontron AG) végezzük, percenkénti 35 000 fordulatszámmal, 15 °C hőmérsékleten, 16 órán át. 0,3 mi térfogatú frakciókat gyűjtünk egy ISCO gradiens gyűjtővel. A frakciók kifolyásának mennyisége 1 ml/perc. A kis fragmenst (azaz a beépült szakaszt) tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. A dezoxi-ribonnkleinsavat ismert módon etanollal kicsapjuk, ér, a csapadékot HB-4 rotorban (Sorval!) 10 000 {percenkénti fordulatszám mellett, ü 'C hőmérsékleten, 10 percen át centrifugálva összegyűjtjük. Az összegyűjtött csapadékot 60 pl, 10 mM írisz-hidrogén-kloridot (pH « 7,5) és 0,05 mM eíilén-diamin-íetraecetsavat tartalmazó elegyben oldjuk. Az optikai sűrűségi mérés szerint 30 pg dezoxi-ribonukleinsavat kapunk. . 10 pg beépített dezoxi-ribomikleinsavat Hae III (Bioiabs.) endonukleázzal emésztünk, és a fragmenseket 2% agarózt tartalmazd gélen frakcionáijuk 50 mM íriszt, 50 mM bórsavat, 1 mM etiiéndiamin-tetraecetsavat és 0,5 pg/ml etidium-bromidot tartalmazó oldatban. A gélről kihasítjuk a legnagyobb dezoxi-ribonuklcínsav-fragmenseket, a 869 bázispárból álló Hae Ill-Pst I és a 82 bázispár‘ ból álló Hae III-Hae III fragmensekeí (lásd a 9. ábrán a 3. és 4. fragmenst). A terméket vékony átmérőjű lyukkal rendelkező tűn vezetjük át, és az alábbi összetételű, 5 ml térfogatú oldatba engedjük: 0,15 M nátrium-klorid, 50 mM trisz-bidrogén-klorid (pH ~ 8,0), 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 eo 55 24
