197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
33 107 047 34 /. táblázat A szacharóz sűrűsági gradiensről nyert frakciók HulFNmRNS aktivitása Frakciók száma interferon aktivitás (egység/nü) 1-18 — 19 162 20 162 21 162 22 162 23 nincs meghatározva 24 729 25 nincs meghatározva 26 405 27 nincs meghatározva 28 486 29 nincs meghatározva 30 162 31 nincs meghatározva 32 162 33 nincs meghatározva 34 54 35-40 nincs meghatározva A 23-29. frakciókat összegyűjtjük, és a bennük levő poIi-(A)-ribonukíeinsavat az alábbiak szerint tisztítjuk: A poli-(A)-ribonukieinsav-o!datot 0,5% nátrium-dodccil-szulfálot tartalmazó, kétszeres töménységű TNE-oIdathoz adjuk, és 200 pl oligo-(di’)celluldz - oszlopra öntjük. Az oszlopot 2 ml kétszeres töménységű TNE-oldatban levő, 0,5% nátrium-dodecil-szulfáttal mossuk, és a poli-(A)-ribonukleinsavat 0,5 ml vízzel ötször eluáljuk. Az eluátumhoz TNE-t adunk, és az oidatot kétszer azonos térfogatú fenollal extraháljuk, ezt előzőleg TNE-oldattal telítjük. Az extrakciót kétszer azonos térfogatú kloroformmal megismételjük. A poli-(A)ribonukleinsavat kétszeres térfogatú etanollal csapjuk ki, —20 °C hőmérsékleten, 10 órán át, és ezt követően HB-4 rotorban centrifugálássa! összegyűjtjük, az előbbiekben megadottak szerint eljárva. A kapott po!i-(A)-ribonukleinsavat 100 pl, 0,5 mM etilén - diamin - tetraecetsavban oldjuk. Az optikai sűrűségi meghatározás szerint 40 pg terméket kapunk. A poli-(A)-ribonukleinsav egy részének humán interferon-aktivitását mérésenként 20 oocitát használva meghatározzuk. Az előállított poli-(A)-ribonukleinsav specifikus aktivitása 8.100 nemzetközi egység interferon/pg ribonukleinsav. 2. példa A kétszdhí cDNS előállítása (I. ábra) Az ld) példában megadottak szerint előállított HulFN mRNS-re dúsított poIi-(A)-ribonukleinsavat templátkéní használjuk a kétszdhí cDNS előállítására. Az előállítást gyakorlatilag Efstratiadis és munkatársai (44), Maniatis ás munkatársai (45) és Hoeijmakers és munkatársai (46) szerint végezzük. a) Az első szál szintézise 250 pl, 40 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH == 7,5), 30 mM nálrium-kloiídot, 5 mM magnéziumkloridot, 0,5 mM ditio-treitolt (Caibiochem), 1 mM dGTP-t, dCTP-t, dTTP-t (P-L Biochemieais) és 1 mM P32-dATP-t (Amersham, specifikus aktivitása 50 000 beütés/perc/nmól), 20 pg/ml oiigo(d T),2_1R polimert (P-L Bíochemicals), 40 pg/ml poli-(A)-ribonukleinsavat és 100 egység madár myeloblastosis vírus (AMV) reverz transzkriptáz enzimet (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida) tartalmazó reakcióelegyet inkubálunk 37 ‘C hőmérsékleten 80 percen át. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az oldatot 10 mM etilén - diamin - tetraecetsav és 0,1% nátrium - dodecil - szulfát koncentrációra állítjuk be. 1 térfogat fenollal egyszer extraháljuk az elegyet. A vizes fázist 1 térfogat kloroformmal extraháljuk, ás 3 mi Sephadex G-50 (Pharmacia, fine) gyantából készült oszlopra öntjük. 0,1 ml térfogatú frakciókat szedünk. Az egyes frakciók radioaktivitását a Cerenkov sugárzásméréssel meghatározzuk. A radioaktív frakciókat összegyűjtjük, és a nukleinsavakat 2 térfogat etanollal, —20 ”C hőmérsékleten, 10 órán át kicsapjuk. A mintát percenként 10 000-et forduló HB-4 rotorban 20 percen át centrifugáljuk, 0 °C hőmérsékleten. A csapadékot 95 pl vízben oldjuk. Ezután 5 pl 10 n nátrium-hidroxidot adunk hozzá, és 40 percen át 25 *C hőmérsékleten inkubálunk. 5 mólos ecetsavvpl semlegesítjük az oidatot, majd 50 p! vizet és 2 térfogat etanolt adunk hozzá, ezután 10 órán át —20 °C hőmérsékleten tároljuk a mintát. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (lásd előbb), és 200 pl, 0,1 mM etilén - diamin - tetraecetsavban újra oldjuk. így 3,7 pg egyszálú cDNS-t kapunk. A cDNS 700-1500 nuklcotid hosszúságú, ahogy azt a 6% poliakrilamid gélen végzett elektroforézises mobilitás jelzi. Az elektroforézist trisz-berát - etilén - diamin - tetraecetsavat tartalmazó oldatban végezzük, ezt úgy állítjuk elő, hogy 1 1, 8,3 pH-jű oldathoz 108 g triszt, 9,3 g dinátrium - etilén - diamin - tetraecetsavat és 55 g bórsavat keverünk. Az oldat 7 M karbamidot is tartalmaz. Az elektroforézist követően ismert hoszszúságú marker dezoxi-ribonukleinsavakkal hasonlítjuk össze a csíkokat (32). b) A második szál szintézise, és Sj cndonitkleázos emésztés A kapott cDNS oldatot 90 percen át 100 °C hőmérsékleten hevítjük, majd lehűtjük, és 40 pl alábbi összetételű reakcióclcgyben inkubáijuk: 0,1 M kálium - foszfát - puffer (pH r5* 6,9), 10 mM magnézium-kioiid, 10 mM elit io-tieitol (Caibiochem.), f mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP (P-L, Biochemicals), 1 mM H3-dGTP (Amersham, specifikus aktivitása 94 000 beütés/perc/nmól) és 165 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
