197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
35 197047 36 egység/ml E. coli DNS polimeráz I (Biolabs, New England). Az inkubáiást 15 “C hőmérsékleten végezzük, 8 órán át. A reakciót etilén - diamin - tetraecetsav és nátrium - dodecil - szulfát adagolásával állítjuk le, ezek végkoncentrációja sorrendben: 10 mM és 0,1%. Az elegyet fenollal és kloroformmal extraháljuk, Sephadex G-50 (Pharmacia, fine, 2 ml gyantaágy-térfogat) oszlopon kromatografáljuk, majd a 2a) példában megadottak szerint etanolial kicsapjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 50 pl alábbi összetételű inkubációs eleggyel kezeljük: 0,25 M nálríum-klorid, 50 mM nátrium-acélát (pH -=*4,5) és 1 mM cink-szulfát, továbbá 6 egység S, endonukleáz (P-L Biochemicals). Az inkubációt 30 percen át végezzük 37 °C hőmérsékleten. A reakciót 0,1% nátrium-dodecil-szulfátra és 10 mM etilén - diamin - telraecctsavra beállítással állítjuk le. 1 térfogat, 50 mM nátrium-acetáttal (pH ■= 4,5) telített fenollal és kloroformmal proteinmentesítjük az elegyet. A vizes fázist 2 ml Sephadex G-50 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk TNE-oldatban. 100 pl-es frakciókat gyűjtünk, és a frakciók Cerenkov-sugárzását meghatározzuk. A kiválasztott frakciókat összegyűjtjük, és a dezoxi-ribonukleinsavat 2 térfogat etanollal —20 ”C hőmérsékleten, 10 óra alatt a fentiekben megadottak szerint eljárva kicsapjuk. A csapadékot HB-4 rotorban (lásd előbb) centrifugáljuk, és az összegyűjtött csapadékot 100 pl, 10 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH — 7,5) és 0,5 mM etilén - diamin - tetraecetsavat tartalmazó oldatban oldjuk. 4 pg dezoxi-ribonukleinsavat kapunk. A dezoxi-ribonukleinsavat szacharóz sűrűségi gradiensen (5—23%) frakcionáljuk, 50 mM triszhidrogén-klorid (pH = 7,5) és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav jelenlétében, TST-60 rotorban (Kontron AG). A ceutrifugálást 5 órán át végezzük, 15 °C hőmérsékleten, percenként 55 000-et forduló rotorban. A 800 bázispárbói álló marker dezoxí-ribonukleinsavaál gyorsabban ülepedő dezoxi-ribonukleinsavat összegyűjtjük, TNE-be öntjük, és 67% etanollal —20 °C hőmérsékleten, 10 órán át kicsapjuk. így 0,4 pg kétszálű cDNS terméket kapunk. 3. példa A pBR 322-höz kötött cDNS előállítása (1. ábra) a) A dCMP-vel meghosszabbított cDNS előállítása 0,1 pg előállított kétszálű cDNS 3’-végét poli(dC)-végekkel látjuk el, 10 pl alábbi összetételű reakcidelcgyben: 100 mM nátrium-kakodilát (pH ** 7,2), 2,5 mM kobald-klorid, 50 pg marhaszérum albumin/ml (Calbiochem.), 1 mM dCTP és 10 egység terminális dezoxi - nukleotidil - transzferáz (P-L Biochemicals) 1 pg kétzsáiú cDNS-re számítva. 20 percen át 27 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 10 mM végkoncentrációig etilén - diamin - tetraecetsavat adunk, és felhasználásig —20 °C hőmérsékleten tároljuk az elegyet. b) A Pst I enzimmel hasított, és a dGMP-vel meghosszabbított pBR 322 előállítása 10 pg pBR 322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység Pst I endonukleázzal (Biolabs.) kezelünk, 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 50 mM nátrium-klorid, 6 mM trisz-hidrogén-klorid (pH = 7,5), 6 mM magnézium-klorid, 6 mM 2 - merkapto - ctanol és 100 pg/ml zselatin. Az inkubálást 1 órán át végezzük, 37 °C hőmérsékleten. Az oldatot 1 térfogat fenollal és 1 térfogat kloroformmal extraháljuk. TNE-hez adjuk az oldatot, és a linearizált dezoxi-ribonukleinsavat 2 térfogat etanollal —20 °C hőmérsékleten 5 órán át tárolva az oldatot kicsapjuk. A linearizált plazmid dezoxi-ribonukleinsavat dGMP-vel hosszabbítjuk meg, 200 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 100 mM nátrium-kakodilát (pH == 7,2), 5 mM magnézium-klorid, 20 mM nátrium-dihidrogén-foszfát, 50 pg/ml marhaszérum albumin, 1 mM dGTP és 100 egység terminális dezoxi-nukleotidil-transzferáz (P-L Biochemicals.). A reakcióelegyet 20 percen át 37 '"C hőmérsékleten i ikubáljuk, majd 10 mmól végkoncentrációig etilén-diamin-tetraecetsavat adunk, és —20 °C hőmérsékleten felhasználásig fagyasztva tároljuk az elegyet. c) A dGMP-vel meghosszabbított pBR 322 hozzákapcsolása a dCMP-vel meghosszabbított kétszálű cDNS-hcz 0,1 pg dCMP-vel meghosszabbított kétszálű cDNS-t és 0,5 pg dGMP-vel végződő linearizált pBR 322 dezoxi-ribonukleinsavat 500 pl TNE- pufferban oldunk, és a reakcióelegyet 1 órán át 65 !C hőmérsékleten, 1 órán át 46 °C hőmérsékleten, L órán át 37 °C hőmérsékleten, és további 1 órán át 20 "C hőmérsékleten inkubáljuk. A pBR 322- höz kapcsolt cDNS-t tartalmazó oldatot jégre hegyezzük, és azonnal felhasználjuk transzformálásra. 4. példa Az E. coli HB 101 transzformálása a kapcsolt hibridplazmiddal Transzformálás céljára kalciummal kezelt E. coli HB 101 sejteket állítunk elő Mandel és munkatársai szerint eljárva (35). 10 pl, a kapcsolt pBR 322 hibrid plazmid dezoxi-riboinikleinsavakat [(3c) példa szerint előállított termék] tartalmazó reakcióelegyet hozzáadunk az alábbi összetételű, 150 pl térfogatú E. coli HB 101 sejteket tartalmazó szuszpenzióhoz: 10 mM magnézium-klorid, 10 mM kalcium-klorid és 10 mM trisz-hidrogén-klorid (pH = 7,5). A reakcióelcgy teljes térfogata 200 pl. Az elegyet 20 percen át jégen tartjuk, majd 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
