197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
31 1S7 047 32 összetétele a következő: 8% nátrium-klorid, 0,2% kálium-klorid, 1,44% nátrium-hidrogén-foszfát és 0,2% kálium-dihidrogén-foszfát. A sejtek összegyűjtése előtt mintát veszünk, és Armstrong (29) módszere szerint humán CCL-23 sejteket és vesicular stomatitis vírust (VSV) használva fertőző vírusként, meghatározzuk interferon aktivitásukat. 4300 interferon egység/ml aktivitást mérünk. b) A sejtek feltárása és protein-mentesítése 50 ml PBS-oldalban levő 6X109 sejtet szobahőmérsékleten, 800 ml lítikus pufféi hoz adunk. A Ií~ tikus puffer összetétele: 0,05 M trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,5; 0,1 M nátrium-klorid, 5 mM etiléndiamin-tetraecetsav és 2% nátrium-dodecil-szulfát (kristályos, kutatási minőségű, Serva). A lizátumot 0,2 mg/ml előinkubált proteázzal kezeljük szobahőmérsékleten, 1 órán át, keverés közben. Az előinkubálás 2 órán át 37 °C hőmérsékleten történik. Proteázként Protease P, VI típus, Sígma terméket használunk. Az oldat protein-mentesítésére 3X500 ml fenollal extrahálunk, amit előzőleg TNE-vel telítettünk. Az extrakciót 500 ml kloroformmal ötször megismételjük. így a 260 nm-en mért abszorpció szerint 500 mg nukleinsavat kapunk. c) A szennyeződezoxi-ribonuklcinsav és ribonukleinsav eltávolítása A fentiek szerint kapott, enyhén viszkózus, vizes oldathoz annyi nátrium-kloridot adunk, hogy végkoncentrációja 0,3 M legyen, majd 1 g oligo-(dT)cellulózt (7-típus, PL Biochemicals) adunk hozzá. 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük a szuszpenziót, majd 1 1-es Sorvall centrifuga csövekben centrifugáljuk Sorvall RC-3 centrifugában, 10 percen át, szobahőmérsékleten, másodpercenként 4000-et forduló rotorban. A kapott oíigo-(dT)cellulóz csapadékot kétszer 40 ml, 0,5% nátriumdodecil-szulfátot tartalmazó, kétszeres töménységű TNE-oldatta! mossuk. A kötött poli-(A)-ribonukleinsavat úgy eluáljuk, hogy ötször 2,5 ml vízzel mosunk. így az optikai sűrűségmérés szerint 720 fig poli-(A)-ribonuklcinsavhoz jutunk. Az első adszorpcióból származó felülúszó ribonukleinsav-oldatot 1 g oligo-(dT)-cellulózhoz adszorbeáljuk, és a fentiek szerint eluáljuk. így 320 pg poli-(A)-ribonukleinsavat kapunk. Az eluátumokat összegyűjtjük, TNE-oldathoz adjuk, és a poli-(A)-ribonuk!einsavat 67%-os etanolos oldattal —20 °C hőmérsékleten, 10 órán át tárolva kicsapjuk. A ribonukleinsavat centrifugálással gyűjtjük össze, a centrifugálást Sorwall RC-5B centrifugában végezzük, 10 percen át, 0 °C hőmérsékleten. Az 1 mg súlyú csapadékot • 1 ml, 1 mM/l-es etilén-diamin-tetraecetsavban újra oldjuk. A ribonukleinsav IIuLyIFN mRNS aktivitásának mérését a Xenopus laevis oocitáiba injektálva határozzuk meg, az alábbiak szerint: 50 ni ribonukleinsav-oldatot injektálunk egyegy, összesen 20 oocitába. Ezeket Barth táptalajban inkubáljuk, ennek összetétele a következő: 2 mM trisz, 88 mM nátrium-klorid, 1 mM káliumklorid, 0,33 mM kalcium-nitrát-monohidrát, 0,41 mM kalcium-klorid-dihidrát, 0,82 mM magnéziurn-szulfát-heptahídrát, 2,4 mM nátrium-hídrogénkarbonát, 0,01 mg/ml penicillin, 0,01 mg/ml sztreptomicin. Az oldat pH-ját hidrogén-kloriddal 7,6-re állítjuk be (lásd Gurdon, 42, Barth, 43 és Col man és munkatársai, 30). A beoltott oocitákat 42-48 órán át inkubáljuk, ezután eltávolítjuk az inkubációs táptalajt, 5 percen át Eppendorf-centrifugában centrifugáljuk, és a felülűszót —20 °C-on -agy —80 'C-on addig tároljuk, míg a mérést el nem végezzük. Az interferon-aktivitást Armstrong (29) szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy fertőző vírusként VSV-t használunk (lásd előbb), ; Iep-2-scjtckkc! (Flow Laboratories). Az oocilák oxtraktumának specifikus aktivitása 600 interferon nemzetközi egység/pg ribonukleinsav. d) A poli-(A)-ribonukleinsav dúsítása HuIFN mRNS-re A poli-(A)-ribonukleinsavat Chelex-100 oszlopon (200—400 mesh) engedjük át. Az oszlopot 0,5 •ni Bio-Rad készítményből állítjuk elő. Az eluálást 1 ml, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsawa! végezzük. Az cluátumot (1 mg poli-(A)-ribonuklcinsav, 2 ml ctilén-diamin-tctraccelsavban) 2 percen át 100 C hőmérsékleten forraljuk, majd szacharóz sűrűségi grádiensen át centrifugáljuk. A szacharóz-oldatot úgy állítjuk elő, hogy 614 ml 5% és 23% közötti mennyiségű szacharózzal kialakított gradienst készítünk, az oldat ezenkívül 50 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH — 7,5), 0,2 M nátrium-kloridot és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmaz. A centrifugálást TST 41 rotorban (Kontron AG) végezzük, percenkénti 35 000 fordulattal, 16 órán át, 5 “C hőmérsékleten. 0,3 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk egy 1SCO gradiens gyűjtővel. A frakciókhoz 2 térfogatnyi ctanolt adunk, és 10 órán át —20 C hőmérsékleten hagyjuk állni az oldatokat. A kivált mRNS-t centrifugálással gyűjtjük össze (Sorwall, HB-4 rotor, 0 ”C hőmérséklet, percenkénti 10 000 fordulatszám, centrifugálási idő: 10 perc). Az egyes frakciók csapadékait 25 pl, 1 mM etiléndiamin-tetraecetsavban oldjuk, és mindegyik frakció humán interferon mRNS aktivitását az le) példában megadottak szerint meghatározzuk, azzal a különbséggel, hogy ribonukleinsav-mintánként nem 20, hanem 10 oocitát injektálunk. Az eredményeket az 1-. táblázatban adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
