197046. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parazitaellenes hatású makrolid vegyületek, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására és az ezeket tartalmazó növényvédőszerek
17. 197046 18 tunk. 2 nap múlva a pH-t 7,2-re állítottuk kénsavval, majd 5 nap múlva learattuk. A 450 1 tenyészközeget lecentrifugáltuk, és a maradék felülúszót 20 1 vízzel eltávolítóttuk. A kinyert sejteket (25,5 kg) 1 dra hosszat kevertük annyi metanolban, amennyi a 75 1 teljes térfogathoz kellett. A szuszpenziót leszűrtük, és a szilán! maradékot 35 1 metanollal újraextraháltuk, és leszűrtük. Az egyesített szűrleteket (87 1) 40 1 vízzel hígítottuk, és PE-vel extraháltuk. 30 perc múlva a fázisokat centrifugálással elválasztottuk, és az alsó, metanolos fázist 40 1 víz hozzáadása után 30 1 PE- vel újraextraháltuk. Elválasztás után az alsó fázist újra 30 1 PE-vel extraháltuk. Az egyesített PE fázisokat (85 1) koncentráltuk három fázisban egy Pfandler 8.8—12V—27 lengőlapátos filmbepárlóban (gőznyomás 0,1 bar, gőzhőmérséklet 20°, fűlőgőz hőmérséklete 127 *C). A kapott 9 1 kcncentrátumot 2 kg nátrium-szulfáton megszárítottuk, és tovább koncentráltuk csökkentett nyomáson, 40 °C-on egy merevlapátos filmbepárlóban. A 130 g olajos maradékot kloroformban oldottuk 190 mire, és ezt CCM-re vittük [oszlop kloroformmal töltve és mosva (500 ml)], 1400 ml előeluátum után kb. 40 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A 32—46. frakciókat egyesítettük és bepárolíuk, így 21,2 g olajat kaptunk. A 47—93. frakciókat egyesítettük és bepároltuk, és így 20,1 g olajat kaptunk, amelyet CHC13-EA 3:1 térfogatarányú elegyben oldottunk 50 ml-re, és CCM-re vittük, 1400 ml előeluátum után mintegy 40 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A 22—36. frakciókat egyesítettük, és bepároltuk, így 3,1 g olajat kaptunk, amelyet a 32—46. frakciókból nyert olajhoz adtunk. Az egyesített olajokat 4 ml forrásban levő metanollal oldottuk, amelyet azután 20 ml forró propán-2-oihoz adtunk, amelyből állás közben 2,57 g B faktor kristályosodott ki. A B faktor kikristályosodása után visszamaradt anyalúgot bepároltuk, a kapott olajat azonos térfogatú diklőr-metánban oldottuk, és egy Merck Kieselgel 60 (70-230 mesh ASTM, Art. No. 7734) oszlopra (30X2,2 cm) vittük, amelyet diklór-metánnal töltöttünk. Az oszlopot kétszeres töltettérfogatnyi diklór-metánna! mostuk, és CHC13-EA 3:1 térfogatarányú, 2 töltettérfogatnyi mennyiségű eleggyel eluáltuk. Az eluátum bepárlásával olajat kaptunk, amelyet metanolban oldottunk, és preparatfv hplc-nek vetettünk alá Spherisorb S5 ODS-2 oszlopon (250 mmX20 mm, Phase Sep. Ltd.). 5 ml mintát 1 perc alatt töltöttünk az oszlopra, és acetonitril és víz 7:3 térfogatarányú elegyével eluáltuk a következő körülmények között: Idő (perc) Átfolyás (ml/perc) 0,00 0,00 Injektálás 1,00 0,00 ideje 1,10 30,00 39,90 30,00 40,00 35,00 75,00 35,00 A hpic oszlopról eluálódott anyagot UV spektroszkópiával vizsgáltuk 238 nm-nél. A 26,3. percnél eluálódott, csúcsot mutató frakciót bepárolva az E faktort kaptuk szilárd tennék formájában. A 36,4. percnél eluálódott, csúcsot mutató egyesített frakciókat bepároíva az F faktort kaptuk szilárd termék formájában. Az E és F faktorok további jellemzőit a későbbiekben ismertetjük. 6. példa A 2. példában leírt módon, 117 óra hosszat tenyésztett fermentumot 121 °C-cn 1 óra hosszat sterileztük, lehűtöttük szobahőmérsékletre, és mágneses keverővei homogén sejtszuszpenzióvá kevertük. Két 2 ml-es részletet lecentrifugáltunk (12000 g, 2 perc, szobahőmérsékleten), a felülúszót dekantáltuk. és a maradék sejteket 2 ml vízben szusznendáltuk, elkevertük, és újra lecentrifugáltuk (12 000 g, 2 perc, szobahőmérsékleten). A felülúszó dekantálása után a sejteket kétszer 2 ml desztillált vízzel mostuk. A mosott sejteket jól elkevertük 2 ml vízben, illetve 2 ml metanolban, szobahőmérsékleten állni hagytuk, egyszcr-egyszer felrázva, 1,5 óra hosszat. A szuszpenziót újra lecentrífugálíuk (12000 g, 2 perc, szobahőmérsékleten), és a felülúszóból vízzel hígítást sort készítettünk. A vizes szuszpenzióból származó sejteket újra szuszpendáltuk vízben, és ebből is hígftási sort készítettünk. Minden hígításból 10 pl részletet vettünk ki, és Caenorhabditis elegáns nematoda 200 pl szuszpenziójához adtuk. A nematodaszuszpenzió 6 g/1 NttdíPO*, 3 g/1 K2HP04, 5 g/1 Nad és 0,25 g/1 MgS04.7H20 tartalmú, 7,0 pH-jú pufferrel készült. 4 óra múlva a nematodaszuszpenziókat megvizsgáltuk arra nézve, hogy a tesztoldatok melyike okozott a nematodák 98%-ánál nagyobb tömegben teljes mozgékonysági gátlást. Úgy találtuk, hogy a metanolos extraktumok 5-szörös, 25-szőrös, 250- szeres és 5G0-szoros hígítása, a sejtszuszpenzió 5-szörös, 25-szörös, 250-szeres, 500-szoros és 1000-szeres hígítása, míg a vizes extraktum 2-szeres, 4-szeres és 8-szoros hígítása okozott ilyen gátlást a nematodáknál, amikor a nematodaszuszpenzió 200 pl-éhez 10 pl mintát adtunk. 7. példa 250 ml-es Erlenmcyer-Ioinbikokban levő 50 ml A tápközeget, ill. 50 ml B tápközeget beoltottunk 0,4 ml, az 1. példa szerint előállított és csövecskében tárolt Streptomycines thermoarchaensis NCIB 12015 spóraszuszpenzióval. A lombikokat 2 napig 28 °C-on inkubáltuk egy 250 fordulat/perc, 50 mm átmérőjű mozgást biztosító rázógépen- 8 ml-es részleteket vettünk ki, és 2 1-es lapos fenekű lombikban levő 400 ml A, illetve B tápközeget oltottunk be vele. A lombikokat ugyanolyan körülmények között inkubáltuk 2 napig. Két 70 1-es fermentort beoltottunk 2-2 lombik A tenyészközeggel, és két másik 70 1-es fermentort 2-2 lombik B tenyészközeggel. A 70 1-cs fermentorok mindegyike 40 1 C tápközeget tartalmazott. A fermentálást 34 °C-on végeztük, keverés és olyan levegőztetés mellett, amely a telítettség 30%-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
