197046. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parazitaellenes hatású makrolid vegyületek, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására és az ezeket tartalmazó növényvédőszerek
ánál magasabb oldott oxigénszintet biztosított, mintegy 24 órai fermentálás után a pH-t vizes kénsavoldattal 7,2-re állítottuk. Polipropilén-glikol 200 habzásgátlót szükség szerint adagoltunk. 5 nap múlva a tenyésztést leállítottuk és a tenyészközeget félretettük. Egy másik 70 1-es fermentort, amely Silicone 1520 (0,06%) habzásgátlóval kiegészített B tápközeget tartalmazott, beoltottunk 2 lombik fenti B tenyészközeggel. A fermentációt 28 *C-on végeztük, keverés és olyan levegőztetés mellett, amely a telítettség 30%-ánál magasabb oldott oxigénszintet biztosított. Polipropilén-glikol 2000 habzásgátlót szükség szerint adagoltunk. 24 óra múlva 9 litert átvittünk egy 700 1-es fermentorba, amely 450 1 C tápközeget tartalmazott. Itt a fermentálást 34 "C-on végeztük, keverés és olyan levegőztetés mellett, amely a telítettség 30%ánál magasabb oldott oxigénszintet biztosított. A habzást polipropilén-glikol 2000 adagolásával akadályoztuk meg. Mintegy 24 órai fermentálás után a pM-t vizes kénsavoldattal 7,2-re állítottuk. 4 nap múlva a tenyésztést leállítottuk és a tenyészközeget a három fenti 40 1-es tenyészközeggel egyesítettük. Az egyesített tenyészközegeket Sharpies AS16PY centrifugán 120 1/óra sebességgel centrifugáltuk, a felülúszót vízzel helyettesítettük a centrifugában. A 11,65 kg kinyert sejtet 33 1 metanolban emulgeáltuk Silverson keverő segítségével. 60 perc múlva a szuszpenziót vásznon átszűrtük, és a maradékot újra emulgeáltuk 34 1 metanolban. 40 perc múlva a szuszpenziót újra leszűrtük. A két metanolos extraktumot egyesítettük. Az egyesített 53,5 I extraktumokat 27 I vízzel és 27 1 PE-vel elegyítettük, 20 percig kevertük, és a két fázist Westfalia MÉM 1256 centrifugán elválasztottuk. Az alsó, 70 1 metanolos fázist 37 1 vízzel és 27 1 PE-vel elegyítettük, és a fenti módon kevertük és elválasztottuk. A két fázis között képződött emulziót 4 1 acetonnal megtörtük. Az alsó, 108 1 metanolos fázist harmadszor is elegyítettük 40 1 vízzel és 27 1 PE-vel, és a fenti módon kevertük és elválasztottuk, az emulzió megtörésére 4 1 acetont használtunk. A három extraktumot ezután egyesítettük. Az egyesített, 85 1 PE-extraktumókát lengőlapátos filmbepárlóban bepároltuk (gőznyomás 0,15 • 105 Pa, gőzhőmérséklet 26 °C). A kapott 3 1 koncentrátumot 2 kg nátrium-szulfáton megszárítottuk, és csökkentett nyomáson, 40 °C-on tovább koncentráltuk. A kapott 639 g olajat 300 ml kloroform-EA 3:1 térfogatarányú elegy ben feloldottuk, leszűrtük és mostuk üvegszál szűrőpapíron. A szűrletet és a mosófolyadékot (1060 ml) CCM-re (1500 mmXlOO mm) vittük, és 6 1/óra sebességgel eluáltuk. A 8,8 és 13,1 liter közötti frakciókat egyesítettük, és alacsony nyomáson bepároltuk, így 56,3 g olajat kaptunk, míg a 13,1 és 24,6 liter közötti frakciókat hasonlóan feldolgozva 153,4 g halványsárga szilárd terméket kaptunk. A korábbi frakciók főleg B faktort, míg a későbbi frakciók az A, B, C és D faktorok elegyét tartalmazták. A későbbi frakciókból a B faktort a GCM kétszeri ismétlésé19 ve! fokozatosan eltávolítottuk, másodszorra friss szilikagélt használva és 3 1/óra sebességgel eluálva. A második oszlopról az A, C és D faktorokat tartalmazó csúcsok a 8,8 és 17,6 1 között eluálódtak, az itt jelenlevő B faktort a harmadik oszlopon távolítottuk el, ahol az A, C és D faktorok a 14 és 28 1 között eluálódtak. Ez utóbbi egyesített eluátumokat csökkentett nyomáson bepároltuk, és így 114 g sziláid terméket kaptunk. A két oszlopról származó, B faktort tartalmazó csúcsokat (7,5—8,8 1, illetve 10,3—13,4 1) bepároltuk, és így 10,7 g, illetve 10 g olajat kaptunk, amelyeket egyesítettünk a három oszlop közül az elsőről származó olajjal. A B faktort tartalmazó olajat 25 ml forró metanolban oldottuk, és elegyítettük 100 ml forró propan-2-ollaI, majd 4 °C-ra lehűtve a B faktort kikristályosftottuk, leszűrtük, 200 ml metanollal mostuk, —20 °C-ra lehűtöttük, vákuumban megszárítottuk, és így 25,3 g B faktort kaptunk. A harmadik oszlopról származó, A, C és D faktort tartalmazó szilárd anyagot vákuumban súlyállandóságig szárítottuk. Ebből a szilárd anyagból 320 mg-os mintákat 190 ml metanolból oldottunk, és acetonitril—víz 7:3 térfogatarányú eleggyel 230 ml-re egészítettünk ki. Az oldatból 5 ml-es részleteket Spherisorb ODS-2 (5 (im szemcseméretű) oszlopon (250 mmX21,2 mm) kromatografáltunk, ehiálószerként acetonitril és víz 7:3 térfogatarányú elegyét használva. Az átfolyási sebességet 10 másodpercig 20 ml/perc értéken tartottuk, majd 22 perc alatt folyamatosan emeltük 34 ml/perc értékig, és ezt az értéket tartottuk további 3 percig. Az eluálódott faktorokat 238 nm-nél detektáltuk. A C faktor 11,0 és 13,4 perc között, a D faktor 13,4 és 17,4 perc között, míg az A faktor 17,4 és 23,0 perc között eluálódott. Az összes kromatográfiás elválasztásból származó, C faktort tartalmazó frakciót egyesítettük, és csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. Az A faktort tartalmazó frakciókat hasonlóképpen szárazra pároltuk. A D faktort tartalmazó frakciókat szintén egyesítettük és bepároltuk, így 7 g szennyezett szilárd terméket kaptunk. Ezt 65 ml metanolban feloldottuk, 7:3 térfogatarányú acetonitril—víz eleggyel kevertük, és Spherisorb ODS2 oszlopon a fenti módon kromatografáltuk, azzal a különbséggel, hogy az átfolyási arányt állandó 20 ml/perc értéken tartottuk. Most a D faktor a 16. és 20. perc között eluálódott, ezeket a frakciókat minden kromatográfiás futtatásból egyesítettük, és szárazra pároltuk. Az A, C és D faktorokat tartalmazó szilárd termékeket vákuumban P2Os fölött súlyállandóságig szárítottuk, így 55 g, 7,0 g, illetve 1,21 g terméket kaptunk. Ezzel az eljárással kapott négy szilárd termék azonosnak mutatkozott az A, B, C és D faktorok autentikus mintáival. 20 8. példa 50 ml B iápközeget tartalmazó 250 ml-es Erlcnmeyer-lombikokat beoltottunk az 1. példa szerint előállított, és csövecskében tárolt 0,5 mi Strep-197046 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
