197046. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parazitaellenes hatású makrolid vegyületek, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására és az ezeket tartalmazó növényvédőszerek
197046 16 mot leszűrtük, CCM nek vetettük alá, és egy 200 ml-es eiőeluátum után 15 ml-es frakciókat gyűröttünk. Az 1 komponenst tartalmazó 124—142. frakciókat összegyűjtöttük és bepároltuk, így 253 mg szilárd terméket kaptunk, amelyből 216 mg-ot hplcvel tisztítottunk (Zorbax ODS, 25x2,1 cm, 80% CH3CN/H20). AII komponenst tartalmazó 250— 320. frakciókat is összegyűjtöttük, bepároltuk, és így 602 mg szilárd terméket kaptunk, amelyből 540 mg-ot hplc-vel tisztítottunk (ahogyan a 124—142. frakciókat). A hplc oszlopról eluált anyagot UV spektroszkópiával vizsgáltuk 243 nm-nél. Az ezen a hullámhosszon abszorbeáló csúcsoknak megfelelő anyagot megszárítottuk, és egyrészt Caenorhabditis elegansszal szembeni aktivitásra vizsgáltuk, másrészt tlcvel analizáltuk. A Caenorhabditis elegans-szal szemben aktív négy csúcs Rf értéke 0,39 és 0,46, illetve 0,70 és 0,75 közé esett. Az I komponens egy csúcsot adott 0,70 és 0,75 Rf érték között, ez a csúcs a B faktornak felelt meg. A II komponens három csúcsot adott 0,39 és 0,46 Rf érték között, ezek az A, C és D faktoroknak feleltek meg. Az A faktor 260 és 340 ml között eluálódott a hplc oszlopról a minta injektálása után, és a tlc-ben az Rf értéke 0,44 volt. A B faktor 270 és 310 ml között eluálódott a hplc oszlopról a minta injektálása után, és a tlc-ben az Rf értéke 0,72 volt. A C faktor 160 és 180 ml között eluálódott a hplc oszlopról a minta injektálása után, és a tlc-ben az Rf értéke 0,4 volt. A D faktor 220 és 250 ml között eluálódott a hplc oszlopról a minta injektálása után, és a tlc-ben az Rf értéke 0,42 volt. Az A, B, C és D faktor további jellemzőit a következőkben ismertetjük. 15 4. példa Az 1. példa szerinti módon előállított, és csövecskében tárolt 0,4 ml Streptomyces thermoarchacnsis NCIB 12015 spóra-szuszpenzióval beoltottunk egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml A tápközeget, és 28 °C-on, 4 napig inkubáltuk egy 250 ford./perc, 50 mm átmérőjű mozgást biztosító rázógépen. Ebből kivett, 8 ml-es részletekkel oltottunk be két 2 1-es lapos fenekű lombikban levő 400 ml A tápközeget, majd ugyanolyan körülmények között 3 napig inkubáltuk. A két lombik tartalmát egy 70 1-es fermentor beoltására használtuk, amely 40 1, Silicone 525-tel (Dow Coming; 0,0625 térf.%) kiegészített B tápközeget tartalmazott. A fermentációt keverés és olyan levegőztetés közben végeztük, amely a telítettség 20%-ánál magasabb oxigénkoncentrációt biztosított, Silicone habzásgátlót szükség szerint adagoltunk. A fermentációt 10 nap múlva állítottuk le, a 40 1 tenyészközeget lecentrifugáltuk (15000 ford./perc). A maradék felülúszót 5 1 vízzel eltávolítottuk, és a kinyert 1,4 kg sejtet —20 °C- on megfagyasztottuk. Egy hét múlva a fagyasztott sejteket felengedtük, 15 1 metanolban szuszpendáltuk, és óvatosan kevertük 15 óra hosszat. Ezután a szuszpenziót leszűrtük, és a sziláid maradékot 10 1 metanollal újraextraháltuk. A 25 1 egyesített szűrletet 12 1 vízzel hígítottuk, és 25 1 PE-vel exíraháltuk. 30 perc múlva a fázisokat centrifugálással szétválasztottuk. Az alsó, metanolos fázist háromszor újraextrahá'tuk PE-vel (25 1, 15 1 és 15 1). Az egyesített PE fázisokat (80 1) koncentráltuk három fázisban egy Pfaudler 8,8—12V—27 lengőlapátos filmbepárlóban (gőznyomás 0,1 bar, gőzhőmérséklet 20 °C, fűtőgőz hőmérséklete 127 °Q, a koncentrátumot (8 1) l kg nátrium-szulfáttal megszárítottuk, és tovább koncentráltuk csökkentett nyomáson 40 °C-on egy merevlapátos filmbepárlóban. A 15 ml olajos maradékot 70 ml CHCI3-EA 3:1 térfogatarányú elegyben oldottuk, és CCM-nek vetettük alá, 1400 ml elő-eluátum után 40 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A 45—65. frakciókat egyesítettük és bepároltuk, így 940 mg B faktort kaptunk (jellemzőit 1. a 3. példában), amelyet metanolból kétszer és nitrometánból átkristályosítottunk. A kristályokat röntgen-diffrakciós kristályanalízissel vizsgáltunk, és megállapítottuk, hogy ortorombos tiszta prizmák, a következő jellemzőkkel: a = 10,171 (3), b - 13,317 (5), c- 25,032 (7) A, F = 3391 A\ Z “ 4, tércsoport ^2,2,2^ Dc =■ 1,18 g/cm3, R = 0,C53 2169-nél, független megfigyelt reflexiók (Oá 58°) diffraktométerben Cu-Kct sugárzással mérve (7 = 1,54178 A). A röntgen-krisztalográfiás szerkezetet az 5. ábra mutatja. 5. példa Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 inokulumot készítettünk a 4. példában ismertetett módon, 2 nap tenyészidővel, és egy 70 1-es fermentorban levő 40 1 1 B tápközeget oltottunk be vele, amely Silicone 525 helyett polipropilén 2000-t tartalmazott (0,06 térf.%). A polipropilén 2000-t a fermentáció során szükség szerint adagoltuk a habzás megakadályozására. A fermentációt 28 °C-on végeztük, keverés és olyan levegőztetés mellett, amely a telítettség 30%-ánál magasabb oldott oxigénszintet biztosított. 24 óra hosszat végzett fermentáció után 9 1 tenyészközeget átvittünk egy 700 1-es fermentorban levő 4501 tápközegbe, amelynek az összetétele a következő: g/1 D-glükóz 2,8 Maláta-dextrin (MD 30E) 27,8 Arkasoy 50 13,9 Melasz 1,7 KjHPC^ 0,14 QrCOj 1,39 Silicone 525 (Dow Corning) 0,06 térf.% A pH a sterilizálás előtt 6,5-re állítva. A fermentációt 28 °C-on végeztük keverés és olyan levegőztetés közben, amely a telítettség 20%-ánál magasabb oxigénszintet biztosított. Polipropilén 2000 habzásgátlót szükség szerint adagol-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
