197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
17 197 045 i8 5 nü PH oldattal egészítjük ki a transzformációs elegyet, majd centrifugáljuk, (5000 fordulat/perc, 10 perc) és 1 ml PH oldatban szuszpendáljuk. A PEG oldat előállítására 7,5 ml 2,5%-cs szacharóz oldathoz 2,5 g polí-etilén-glikolt, 0,0014 mól vizes kálium-szulfátot, 0,1 mól vizes kalciumklorid oldatot, 0,05 mól Trisz-maleinsav-puffert (pH 8,0) és 0,05 inl nyomelem oldatot (lásd előbb) adunk. A transzformációs elegy 0,1—0,1 ml-ét R2YE szilárd halmazállapotú táptalajokra szélesztjük és 28 °C hőmérsékleten 5 napon át inkubáljuk. A táplalajok egy részére lő órás inkubációt követően 80 ug/ml neomicint és/vugy 50 pg/ml kloramfenikolt tartalmazó R2YE táptalajt rétegezünk. 4—5 nap múlva a táptalaj felületén a regenerálódott protoplasztokból kifejlődött telepek figyelhetők meg. Az R2YE antibiotikum mentes táptalajon kifejlődött telepeket összegyűjtjük és 80 pg/ml neomicint és/ vagy 50 pg/ml kloramfenikolt tartalmazó R2YE táptalaj felületére szélesztjük. 5 napon át 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd izoláljuk a NeoRCmR telepeket. Ugyancsak izoláljuk az antibiotikum(okat) tartalmazó táptalajjal rétegezett lemezeken kinövő telepeket (NeoRCmR). Megjegyezzük, hogy a pGYOKI2 plazmidot nem tartalmazó Streptomyces lividans 66 sejtek 10 pg/ml neonácin és 20 pg/ml kloramfenikol jelenlétében nem növekszenek. A transzformációs frekvencia 320 transzformáns/1 pg DNS. Az izolált telepek ltzH' karakterét megvizsgáljuk, R2YE táptalajok felületére 0,1 ml, Streptomyces lividans 66 spórákat tartalmazó (ÍOVml) spóraszuszpenziót szélesztünk, majd az izolált, pGYOK12 rekombináns plazmidot tartalmazó, NeoRCmR telepekből készült spóraszuszpenziókat, megfelelő hígítás után egyenként rászélesztjük a Str. lividans 66 spórákkal már fedett táptalajok felületére. 5 napon át 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, amikor a lemezeken „pock”-ok jelennek meg (lásd a 8. ábrát). A pock-okat formáló (ltz+) és NeoRCmR telepekből készült R2YE ferdeagarokat 4 °C hőmérsékleten tároljuk. Egy ltz+NeoRCmR törzset Streptomyces lividans pGYOKf2-nek neveztünk el és [NCAIM B(P) 000259] sorszámon letétbe helyeztünk. C A pGYOKJ2plazmid izolálása a Streptomyces lividanspGYOKH [NCAIM B(P) 000259] sejtekből Az 1. példa A. pontjában megadottak szerint te nyésztjük a Str. lividans pGYOK!2 (NCAIM B(P) 000259] törzset, a pGYOKÍ2 plazmid izolálásra az 1. példa B. pontjában megadottakat ismételjük meg. Az izolált plazmid DNS-t TE oldatban —20 °C hőmérsékleten tároljuk. 7. példa Az E. coli JF1754 transzformálása Str. lividans pGYOK121NCAIM B(P) 000259] törzsből izolált rekombináns pGYOK!2 plazmid DNS vektorral A 6. példa C. pontjában megadottak szerint Streptomyces lividans pGYOKI2 [NCAIM B(P) 000259] törzsből izolált pGYOKI2 plazmid készítménnyel a 4. példában megadottak szerint eljárva E. coli JF1754 sejteket transzformálunk és a sejteket az ott megadottak szerint szelektáljuk. Transzformációs frekvencia: 74 transzformáns/1 pg DNS. A plazmid restrikciós analízisét a 4. példában megadottak szerint végezzük el. Az analízis eredményei a 6. ábrán megadottal azonosak (lásd még a 9. ábrát). S. példa A Streptomyces tenebraríus transzformálása pGYOKI2 rekombinánsplazmiddal A. A Streptomyces tenebraríus tenyésztése A Streptomyces tenebraríus [NCAIM B(P) 000204] törzset Bennett-agaron agar összetétele a következő: tartjuk fent. Az Húskivonat (Láb Lemco) 0,1% Élesztőkivonat (Gxoid) Kazein (10%-os, 0,1% enzimatikusan hidrolizált) 2,0% Kobalt-klorid-hexahidrát 0,001% Glicerin 1,0% Glutaminsav 0,2% Agar (Bacto) 2,0% A táptalaj pH-ját sterilezés előtt híg vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be, a sterilezést 30 percen át 121 °C hőmérsékleten végezzük. Az 5 napon át tartó, 37 °C hőmérsékleten kivitelezett inkubációt követően steril desztillált vízzel spóraszuszpenziót készítünk, majd ezzel PPF2 jelű táptalajokat oltunk a 6. példa A. pontja szerint eljárva. A tenyésztési ugyancsak a fentiek szerint végezzük, azzal a külöbséggel, hogy 37 °C hőmérsékleten addig folytatjuk a rázást és átoltást, míg az Str. tenebraríus sejtek 3,5% glicin jelenlétében növekednek. . B. A Streptomyces tenebraríus transzformálása pGYOKI2 rekombináns plazmiddal A jelen példa A. pontjában megadottak szerint előállított tenyészetet a 6. példa B. pontja szerint eljárva pGYOK.12 plazmid DNS-sel transzformáljuk. A transzformációs elegyet R2YE és 24 órás inkubációt követően 50 pg/ml kloramfenikollal rétegezett R2YE táptalajokra szélesztjük, majd 37 "C hőmérsékleten inkubáiunk, 6 napon át. Ezután az R2YE táptalajról összegyűjtjük a regenerált protoplasztokból kinőlf telepeket és 0 és 150 pg/ml közötti mennyiségű kloramfenikolt tartalmazó táptalajra szélesztjük, majd 6 napos inkubációt követően megállapítjuk a telepek rezisztenciájának mértékét és a rezisztens telepek számát. Ugyanezt elvégezzük a kloramfenikol jelenlétében regenerált tenyészettel. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65 10
