197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
19 197 045 20 2. táblázat Kloramfenikol, pg/ml Törzs 0 20 30 50 80 120 150 Str. tenebrarius NCAIM B(P) 000204 kontroll 1X106 5X105 1X1Ü1 0 0 0 0 Str. tenebrarius, Cm1 nélkül regenerálva 6X105 9X10J 8X10J 8xHP 3x10' 0 0 Str. tenebrarius, Cm* jelenlétében regenerálva 9X103 8XHP 1X104 8X10-’ 6x HP 7X102 0 1 Cm: kloramfenikol A táblázat adataiból kiderül, hogy a pGYOKI2 plazmiddal transzformált Streptomyces tenebrarius [NCAIM B(P) 000204] sejtekben a pGYOKI2 által meghatározott CmR gén kifejeződik. A transzformációs frekvencia 19 transzformáns/3 pg DNS. 9. példa A pGYOK125 rekombináns, Tn5 transzpozont tartalmazó plazmid vektor előállítása A. Az E. coli UNF510 transzformálásapGYOKI2 rekombináns plazmiddal A pGYOKI2 rekombináns plazmid izolálására megismételjük az 5. példában megadott eljárást. A transzformálást és a szelektálást az E. coli UNF510 Tn5 [NCAIM B(P) 000262] sejtekkel a 4. példában megadottak szerint végezzük. B. A pGYOKI25 rekombináns, Tn5 transzpozont hordozó plazmid DNS izolálása A jelen példa A pontjában megadottak szerint végzett transzformálás után kapott CmR E. coli UNF510 pGYOK12 sejteket a 2. példa A. pontja szerint tenyésztjük, majd a 2. példa B. pontjában megadottakat ezzel a tenyészettel megismételve izoláljuk a pGYOK12 plazmidot. A plazmid készítménnyel a 4. példában megadottak szerint E. coli HB101 sejteket transzformálunk. Az E. coli HB101 sejteket a 2. példa A. pontja szerint eljárva tenyésztjük. A transzformációs elegyet a 4. példa szerint szőlészt] fik, de a szelektálást nemcsak kloramfcnikolra, hanem kanamicinre is elvégezzük. A szelektív táptalaj milliliterenként 20 pg kanamicint tartalmaz. A CraR és KmR transzformánsokból a 2. példa A. és B. pontja szerint eljárva izoláljuk a Tn5 transzpozont tartalmazó és pGYOKI25-nek elnevezett plazmidot. A példa szerinti eljárást a 7. ábrán sematikusan 3q szemléltetjük. A pGYOKI25 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a 12. ábrán adjuk meg, a lestrikciós analízis eredményeit a 6B. ábrán adjuk meg. Az Escherichia coli pGYOKI25 törzset [NCA!M B(P) 000266] sorszámon letétbe helyeztük a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében. 40 10. példa A Streptomyces lividanspGYOKI25 előállítása A Streptomyces lividans pGYOK125 előállításása a 6. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 6. példa B. pontjában s merte tett transzformálást a 2. példa A. és B. pontjában megadottak szerint E. coli pGYOKI25 ÍNCAIM B(P) 000266] törzsből izolált pGYO- gQ ÍCI25 rekombináns, Tn5 transzpozont tartalmazó plazmid DNS-sel végezzük. A transzformánsok szelektálását 80 pg/ml neomicint és/vagy 50 pg/ml kloramfenikolt és/vagy 50 pg/ml kanamicint tartalmazó R2YE táptalajon 55 végezzük. A kinőtt NeoRCmRKmR telepek tartalmazzák a pGYOKI25 rekombináns, Tn5 transzpozont hordozó plazmidot. A 6. példa B. pontjában megadottakkal azonosan végzett kísérlet szerint a pGYOK125 konjuga- 50 tív plazmid, a plazmidot nem tartalmazó Str. lividans sejtekkel „lethal zygosist” ad. A Str. lividans pGYOKI25 Neo'KWKm'Mt/.1 törzset [NCAIM B(P) 000260] sorszámon letétbe helyeztük a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganiz- 65 musok Nemzeti Gyűjteményébe. 11
