197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
16 transzformáns/1 fig DNS) és a 2Á., illetve 2B. példákban megadottak szerint tenyésztjük, illetve plazmid DNS-t izolálunk. Az izolált pGYOKIl és pGYOKI2 plazmidokat restrikciós endonukleázokkal a 3. példában megadottak szerint kezelve, analizáljuk. Restrikciós enzimként EcoRI, BamHI, Hindlll és Kpnl endonukleázokat használunk (BRL, Maryland, USA). Az emésztett minták 10— 10 fxl-éhez 10—10 pl D puffert adunk és agaróz gélen gélelektroforézist végezve elválasztjuk a keletkezett DNS fragmenseket. A D puffer előállítására 5 ml 80%-os szacharózt, 0,01 g bróm-fenolkéket, 0,4 ml 1 mólos vizes Trisz-HCl-ot (pH 7,5) és 4,1 ml desztillált vizet adunk. Az agaróz gélt az alábbiak szerint készítjük el: 1 g agarózt (Sigma, St. Louis, USA) hozzáadunk 80 ml TEA pufferhoz és 2 percig forraljuk a szuszpenziót. Ezután 60 °C hőmérsékletre hűtjük és horizontális gélt öntünk. A TEA puffer előállítására 800 ml desztillált vízben oldunk 48,4 g Triszt, 3,7 g Na;EDTA-t, 16,4 Na-acetátot, 0,05 ml 10 mg/ml-es koncentrációjú etidium-bromidot, az elegy pH-ját koncentrált ecetsavval 8,3-ra állítjuk be, majd desztillált vízzel 1000 ml-re egészítjük ki A restrikciós endonukleázokkal kezelt pGYOKI1 és pGYOK12 DNS fragmenseket tartalmazó oldatokat ezután rácseppentjük a gélre és 4 órán át TEA pufferban elektroforetizálunk (40 V, 40 mA). A különböző nagyságú DNS fragmenseknek megfelelő DNS sávokat UV fény melletti fluoreszkálásuk alapján figyeljük meg, azonosítjuk és fényképezzük. A restrikciós analízis eredményeit a 6. ábrán adjuk meg (lásd előbb), az 5. ábrán pedig megadjuk az analízis eredményéből szerkesztett restrikciós és funkcionális térképeket. A pGYOKIl és pGYOKI2 rekombináns plazmidokat tartalmazó E. coli törzseket E. coli pGYOKIÍ-nek, illetve E. coli pGYOKI2-nek neveztük el. Az utóbbit letétbe helyeztük a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Gyűjteményébe, ahol az [NCAIM B(P) 000265] sorszámot kapta. 5. példa A pGYOKIl és pGYOKIl rekombináns plazmid izolálása E. coli pGYOKIl, illetve E. coli pGYOKIl sejtekből Az E. coli pGYOKIl és E. coli pGYOKI2 [NCAIM B(P) 000265] törzset a 2. példa A. pontjában megadottak szerint tároljuk és tenyésztjük plazmid izolálásra. A plazmidokat a 2. példa B. pontjában megadottak szerint izoláljuk. 6. példa A Streptomyces lividanspGYOKIl előállítása A. A Sít. lividans 66 tenyésztése A Str. lividans 66 [NCAIM B(P) 000257] törzset R2YE agaron tartjuk fent. Az agar összetételét az 1. példa A. pontjában megadtuk. A ferdeagn.r tenyészeteket 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk, n ajd 4 °C hőmérsékleten tároljuk. A ferdegarral nyert spóraszuszpenzióval beoltjuk az alábbi összetételű, 100 ml térfogatú, 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 30 percen át 121 °C hőmérsékleten steriíezett táptalajt (PPF2): Glükóz 1,0% Élesztőkivonat (Oxoid) 1,0% Kalcium-klorid-dihidrát 0,3% Magnézium-klorid-hcxahidrát 0,6% Szacharóz 10,3%. A táptalaj pH-ját 50%-os vizes nátrium-hidroxid oldattal 7,2-re állítjuk be. A tenyészeteket 48 órán át 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk olyan rázógépen, amely percenként 260-at fordul körkörös kitéréssel. A 48 óra múlva a kinőtt tenyészet 10%-ával 0,5% glicint tartalmazó PPF2 táptalajt oltunk, majd kinövés után az átcltást 1,0% glicint tartalmazó táptalajra megismételjük. A növesztést 40—46 órán át folytatjuk, ekkor a sejtek logaritmikus növekedési fázisban vannak. B. A Str. lividans 66 transzformálása pGYOKIl rekombináns plazmid DNS-sel Az A. pont szerint tenyésztett sejteket centrifugáljuk (5000 fordulat/perc, 10 perc), az üledéket pH oldattal mossuk. A pH oldat előállítására 80 ml desztillált vízben 13 g szacharózt, 0,025 g káliumrzulfátot, 0,203 g magnézium-klorid-hexahidrátot és 0,2 ml nyomelem oldatot oldunk, majd sterilez; ük (30 perc, 121 °C). A nyomelem oldat összetéielét az 1. példa A. pontjában megadtuk. A steril elegyhfz 1 ml steril 0,5%-os vizes kálium-dihídrogén-foszfát, 10 ml steril 3,68%-os vizes kalcium-klorid-dihidrát oldatot és 10 ml steril TES puffert (pH 7,2 ) adunk. A TES puffer összetétele:- 10 mM Trisz-HCL 1 mM EDTA 5 mM nátrium-klorid A PH oldattal mosott sejteket 4 ml, 1 mg/ml lizozimot (Serva) tartalmazd PH oldatban szuszpendáljuk, majd protoplasztok előállítására 3 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk, enyhe rázás közben (40 kitérés/perc). A protoplasztokat tartalmazó szuszpenziót centrifugáljuk (5000 fordulat/ perc, 10 perc) 4 ml PH oldatban szuszpendáljuk, majd megismételjük a centrifugálást. A protoplasztokat 50 pl PH oldatban szuszpendáljuk, majd 10 pl protoplaszt szuszpenzióhoz hozzáadunk 10 pl, az 5. példában megadottak szerint E. coli pGYOKI2 [NCAIM B(P) 000265] sejtekből izolált pGYOKI2 rekombináns plazmidot tartalmazó TE oldatot. Az elegyhez 0,5 ml PEG oldatot adunk, majd óvatosan rázogatjuk az elegyek 1 perc múlva 97 045 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
