197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
23 197 045 24 B. Az auxotrófok számának meghatározása A fentiek szerint szélesztett tenyészeteket 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk 5 napon át, majd a telepek egy részét 2,5% agart (Bacto) tartalmazó T13 és T13-cas lemezekre replikázzuk. 5 napon át 28 *C hőmérsékleten tenyésztünk, majd meghatározzuk a minimal táptalajon (T13) nem növekvő (auxotróf) sejtek számát. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg (lásd előbb). A táblázat adataiból kiderül, hogy míg a pGYOKI25 rekombináns plazmidot nem tartalmazó Str. lividans 66 tenyészetből auxotróf sejtet érthetően nem tudtunk izolálni, addig a Tn5 transzpozont hordozó plazmidot tartalmazó Str. lividans pGYOKI25 [NCAIM B(P) 0002601 törzsből egyszerű tenyésztéssel 2,7% penicillines dúsítással 3,6% auxotrófot izoláltunk. Három auxotróf aminosav igényét megvizsgáltuk, kettő közülük arg~-nak, egy lys--nak bizonyult. C. A Str. lividans pGYOKI2 5 [NCAIM B(P) 000260] morfológiai variánsainak megfigyelése A jelen példa A. és B. pontja szerint, agart tartalmazó T13-cas szilárd halmazállapotú táptalajra replikázott telepek egy részét R2YE táptalajra (lásd 1. példa) replikázzuk. Ezen a táptalajon a mikroorganizmus gyorsan növekszik és jól spórázik. A tenyészeteket 6 napon át 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd morfológiai szempontból megvizsgáljuk a telepeket. Úgy találtuk, hogy a vizsgált 204 telep közül 36 morfológiája valamilyen szempontból megváltozott. Egyes telepek légmicéliumot nem fejlesztenek, mások sötétkék, ismét mások piros színű oldódó színanyagot termelnek. A légmicéliumok fejlődése különböző. Néhány morfológiai variánst a 10. ábrán mutatunk be. 13. példa A Streptomyces lividans 66[NCAIM B(P) 000257] transzformálása pl 011 plazmiddal A. A plOll p/azmid izolálása A plOll plazmid funkcionális és restrikciós térképét a 11. ábrán mutatjuk be. A plazmid Tn5 transzpozont tartalmaz, a transzpozonon kanamicin és streptomicin rezisztenciát meghatározó gén (KmRSmR) található. A plazmid más részén kloramfenikol rezisztenciát biztosító gén (CmR) van. A plOll plazmid izolálására az Escherichia coli plOll [NCAIM B(P) 000264] törzset a 2. példa A. pontja szerint tenyésztjük és a plazmid DNS-t a tenyészetből a 2. példa B. pontjában megadottakat megismételve izoláljuk. A tiszta plOll DNS-t —20 °C hőmérsékleten oldatban tároljuk. B. Str. lividans transzformálása plOll plazmid DNS-sel A Str. lividans 66 [NCAIM B(P) 000257] mikroorganizmust a 6. példa A. pontja szerint tenyésztjük, majd az előállított protoplasztokat a 6. példa B. pontja szerint transzformáljuk a fentiekben (jelen példa A. pont) megadottak szerint előállított plOll plazmid DNS-sel. Transzformáláskor TXlOVml protoplaszthoz 1 pg plOll DNS-t adunk. A transzformációs elegy 0,1—0,1 ml-ét megfelelő hígítások után R2YE (lásd 1. példa) táptalajokra szélesztjük, majd 28 °C hőmérsékleten inkubálank. 16 óra múlva a tenyészetek negyed részére R2YE táptalajt, negyed részére 60 pg/ml kloramí jnikol, negyed részére 120 pg/ml kanamicin és utolsó részére 60 pg/ml kanamicin és 60 pg/ml kloramfenikol végkoncentrációt kialakító mennyiségű antibiotikumot tartalmazó R2YE táptalajt rétsgezünk. Ilyen mennyiségű antibiotikum(ok) mellett a plOll plazmidot fel nem vett sejtek nem nőlek ki. Az inkubációt 28 °C hőmérsékleten 6 napon át folytatjuk. C A plOll Km* és CmR gének kifejeződésének vizsgálata A kinőtt R2YE és R2YE+antibiotikumos tenyészetekben lévő telepek számát meghatározzuk. Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg. 3. táblázat A plOll KmR és CmR génjeinek kifejeződése Str. lividansban Táptalaj R2YE Telepek száma drb/0,1 ml transzformációs elegy+-6.4X107 +120 pg/ml kanamicin 3,1X105 +60 pg/ml kloramfenikol © X +60 pg/ml kanamicin és 60 pg/ml kloramfenikol 3X101 +A transzformációs elegy 7X107/0,1 ml protoplasztot tartalmaz, ebből 6,4X107 regenerálódik. A táblázatból kiderül, hogy a plOll plazmid Tn5 része által meghatározott kanamicin rezisztenciára nézve 0,5%-os a transzformációs frekvencia, jóval kisebb frekvenciával megjelentek kloramfenikol rezisztens telepek. A tenyészetekből ezután kloramfenikolt és/vagy kanamicint tartalmazó R2YE táptalajokon repíikázva KnrRCmR, KmsCmR és KmRCms fenotfpusokat izoláltunk. Mivel a plOll plazmid nem tartalmaz Streptomyces replikációs origót, Streptomyces lividans-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
