197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
2.5 197 045 26 ban nem maradhat fent. A kanamicin reziszlens sejtekben a plOll plazmid DNS Tn5 szakaszának a kromoszómába kell beépülnie. A Tn5 a kromoszóma különböző helyeire beépülve mutációkat okozhat. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás antibiotikum rezisztenciát meghatározó DNS szakaszokat tartalmazó, Streptomyces és Escherichia coli sejtekben replikálódó, bifunkcionális, adott esetben transzpozont hordozó tij rckombináns DNS klónozó vektorok előállítására, azzal jellemezve, hogy a) Streptomyces lividans eredetű funkcionális replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket tartalmazó DNS fragmemsl, és b) Escherichia coliban funkcionális replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket tartalmazó DNS fragmenst, és adott esetben c) antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket tartalmazó transzpozon DNS-t összekapcsolunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás pGYOKli, és pGYOKI2 rekombináns plazmidok és ezek beépülési izomerjei előállítására, azzal jellemezve, hogy a pIJ41 és a pACYC184 plazmidokat restrikciós endonukleázzal hasítjuk, s a kapott lineáris DNS fragmensekeí T4 DNS ligázzal.összekapcsoljuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás bifunkcionális, transzpozont hordozd rekombináns DNS vektorplazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy transzpozont tartalmazó sejteket valamely, az 1, igénypont szerint előállított, bifunkcionális, rekombináns plazmiddal transzformálunk, majd a transzformánsokbó! tenyésztést követően izoláljuk a transzpozont hordozó rekombináns plazmidokat. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás pGYOK125 rekombináns bifunkcionális plazmid és beépülési izomeijei el(5állítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti pGYOKI2 rekombináns plazmiddal valamely Tn5 transzpozont tartalmazó sejtet transzformálunk, a transzformált sejteket tenyésztjük, és a sejtekből a Tn5 transzpozont hordozó pGYOKI25 rekombináns plazmidot és beépülést izomerjeit izoláljuk. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pGYOKI2 rekombináns plazmiddal Tn5 transzpozont tartalmazó E. coli UNF510 sejtet transzformálunk, a transzformánsokat tenyésztjük, tenyésztést követően izoláljuk belőlük a plazmidot, amelyet E. coli JF1574 sejtbe juttatunk, majd a kapott transzformánsokat antibiotikum rezisztencia alapján szelektáljuk és belőlük a Tn5 transzpozont hordozó pGYOK125 rekombináns plazmidot és beépülési izomerjeit elkülönítjük. 6. Eljárás antibiotikum rezisztenciát meghatározó DNS szakaszokat tartalmazó, Streptomyces és Escherichia coli sejtekben replikálódó, bifunkcionális, adott esetben transzpozont hordozó új re-Kombináns DNS klónozó vektorokat tartalmazó nanszformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy a) Streptomyces lividans eredetű funkcionális replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket tartalmazó DNS fragmenst és b) Escherichia coliban funkcionális replikációs origót és antibiotikum rezisztenciát meghatározd géneket tartalmazó DNS fragmenst és adott esetben c) antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket tartalmazó transzpozon DNS-t összekapcsolunk, majd az így kapott rekombináns DNS klónozó vektorral Streptomyces vagy Escherichia coli sejteket transzformálunk és a transzformánsokat szelektáljuk. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás pGYOKli és pGYOK12 rekombináns plazmidokat, valamint ezek beépülési izomerjeit tartalmazó transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy a plJ41 és a pACYCl84 plazmidokat restrikciós endcnukleázzal hasítjuk, a DNS fragmensekef T4 DNS ligázzal összekötjük, majd az így kapott rekombináns DNS vektor plazmídokkaí Streptomyces vagy Escherichia coli sejteket transzformálunk. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás bifunkcionális, transzpozont hordozó rekombináns DNS vektor plazmidokat tartalmazó transzíormánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy transzpozont tartalmazó sejteket valamely, az 1. igénypont szerint előállított, bifunkcionális, rekombináns plazmiddal transzformálunk, a transzformánsokból tenyésztést követően izoláljuk a transzpozont hordozó rekombináns plazmidokat és ezeket baktérium sejtekbe juttatjuk. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás Tn5 transzpozont hordozó pGYOKI25 rekombináns, bifunkcionális plazmidot és beépülési izomerjeit tartalmazó transzíormánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti pGYÜK12 rekombináns plazmiddal valamely Tn5 transzpozont tartalmazó sejtet transzformálunk, a transzformált sejteket tenyésztjük, a sejtekből izoláljuk a Tn5 transzpozont hordozó pGYOKI25 rekombináns plazmidot, majd az így kapott DNS-sel Escherichia coli vagy Streptomyces sejteket transzformálunk. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás Streptomyces transzformánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy pGYOKI25 rekombináns, transzpozont hordozó, bifunkcionális plazmid DNS vektorral antibiotikum termelő Streptomyces sejteket transzformálunk. 11. Eljárás Streptomyces mutánsok előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces sejteket transzpozon DNS-t tartalmazó plazmid DNS-sel transzformálunk, majd szelekciót követően izoláljuk a mutánsokat. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces sejteket a pGYOK125 rekombináns plazmid DNS-sel transzformáljuk. 13. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces sejteket a plüll hibrid plazmiddal transzformáljuk. R 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14 13 db rajz
