197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
21 197 045 22 A Str. livldans pGYOKI25 [NCAIM B(P) 000260] törzs tartalmazza a Tn5-szekvenciát. Ezt DNS-DNS hibridizációval bizonyítjuk. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett Strcptomyces lividans pGYOKI25 DNS-t 1%-os agaróz (Sigma, St. Louis, USA) gélen elektroforetizáljuk (80 V, 80 mA) 4 órán át. 30 percen át desztillált vízzel mossuk a gélt, majd két celofánpapír között kiszárítjuk és a DNS-t 30 percen át denaturáljuk 0,5M nátrium-hidroxidot és 1,0M nátrium-kloridot tartalmazó elegyben. A denaturálás után 0,3M nátrium-kloridot, 0,30M nátrium-citrátot és 0,05M nátrium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó 7,0 pH-jú eleggyel mossuk a gélt, majd 4 órán át az alábbi összetételű preliibridizációs elegyben inkubáljuk, 37 °C hőmérsékleten: 0,3M nátrium-klorid, 0,Ü3M nátirum-citrát, 0,05M nátrium-dihidrogén-foszfát, 50% formamid, 0,1% nátríum-lauril-szulfát, 400 pg/ml csirkevér DNS (Reanal, Budapest). 0,1% Ficoll (Sigma, St. Louis, USA), 0,1% polivinil-pirrolidin és 0,1% marha szérum albumin. Ezután a prehibridízáeics oldathoz hozzáadjuk a I,32-izotóppa! jelzett, Tn5 specifikus DNS (Izotóp Intézet, Budapest) próbát és 24 órán át 37 °C hőmérsékleten híbridízálunk. A gélt az alábbi elegygyel mossuk: 0,3M nátrium-klorid, 0,03M nátrium-citrát, 0,05M nátrium-dihidrogén-foszfát és 0,1% nátrium-lauril-szulfát, pH 7,0. A mosási addig folytatjuk, míg a inosófolyadék izotópmentes. Ezt követően szántjuk a gélt, majd röntgenfilm (Medifort, RP, Magyarország) ráhelyezésével autoradiografáljuk. Az eredményeket a 13. ábrán adjuk meg. Az ábrákon látható, hogy a pGYOK125-öt hordozó Streptomyces lividans-ból izolált DNS tartalmazza a Tn5 specifikus szekvenciát. A Str. lividans pGYOK125 sejtekből a pGYOK125 plazmidot az 1. példa A. és B. pontja szerint izoláljuk, az izolált DNS-sel E. coli sejteket a 4. példa szerinti eljárással transzformálunk. A transzformáns E. coli sejtekből a plazmidot a 2. példa A. és B. pontja szerint eljárva izoláljuk. A plazmid gélelektrofoietikus képét a 9. ábrán adjuk meg. 11. példa A Str. tenebrarius transzformálásapGYC)K125 rekombináns plazmáddal A Streptomyces tenebrarius [NCAIM B(P) 000204] törzs tenyésztését és transzformálását a 8. példa A. és B. pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a transzformálást a pGYOKI2 plazmid helyett a 9. példa B. pontja szerint előállított E. coli pGYOK125 [NCAIM B(P) 000266] törzsből a 2. példa A. és B. pontja szerint izolált pGYOKI25 plazmáddal végezzük. A transzformánsok szelektálását a 8. példa B. pontja szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a regenerálást R2YE és 80 pg/ml kloramfeníkolt tartalmazó táptalajon végezzük, majd a regenerált telepeket 80, 120 és 150 pg/ml kloramfenikolt tartalmazó R2YE táptalajra átoltva izoláljuk a 120 pg/ml kloramfenikolon növekvő sejteket. Transzformációs frekvencia: 27 telep/3 pg DNS. 12. példa Mutánsok elődllfiúsa a pGYOKI25 rekombináns plazmidot tartalmazó Str. lividans /NCAIM B(P) 000260] törzsből A. A Streptomyces lividanspGYOKI25 tenyésztése és az auxotrófok dúsítása Az 1. példa A. pontja szerinti ferdeagaron tárolt Str. lividans pGYOK125 [NCAIM B(P) 000260] és kontrollként a Str. lividans 66 [NCAIM B(P) 000257] spóráival az alábbi összetételű T13-cas jelű táptalajt oltjuk: Glükóz 1,0% Animónium-szullát 0,5% Magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1% Kálium-dihídrogén-foszfát 0,1% Kazaminsav 0,4% Vitamin oldat** 0,1 tnl/100 ml. +A vitamin oldat összetétele a következő: Fólsav 0,2 mg Biotin 0,2 mg Kalcium-pantotenát 40,0 mg Inozit 200.0 mg Niacin 40,0 mg p-amino-benzoesav 20,0 mg Piridoxin-HCl 40,0 mg Aneurin-HCl 40,0 mg Riboflavin 20,0 mg Desztillált víz 100,0 ml-re kiegészítve. A táptalaj pH-ját stcrilezés előtt 7,2-re állítjuk be, majd 30 percen át 121 °C hőmérsékleten sterilezzük. Az 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterílezett 100 ml térfogatú tenyészeteket 48 órán át percenként 260-at forduló sfkrázógépen rázzuk, 28 °C hőmérsékleten. A tenyésztés befejezése után a tenyészet milliliterenként 3X108 sejtet tartalmaz. Centrifugálással (5000 fordulat/perc) összegyűjtjük a sejteket és kétszer TI 3 táptalajjal mossuk. Ennek összetétele azonos a Ti3-cas táptalaj összetételévei, de kazaminsavat nem tartalmaz. Az utolsó mosás után T13 táptalajban szuszpendáljuk a sejteket majd TI 3 és T13-cas táptalajokat oltunk. A tenyésztést a fentiek szerint végezzük 24 órán át, de a TI3 táptalajba a tenyésztés 6. órájában 500 E/ml penicillint adunk az auxotrófok dúsítására. A tenyésztés befejeződése után centrifugálással (5000 fordulat/jierc, 10 perc) egyszer mossuk a sejteket, majd megjelelő hígítás után 2,5% agait (Bacto) tartalmazó TI 3- cas táptalajra szélesztjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
