197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
23 197 044 használjuk. A kapott telepeket a várt fenotípusra szelektáljuk (AmpR, Tets, CMS), és így, megkapjuk az előállítani kívánt E. coli KI 2 C60()Rk—Mk—/ pJL 125 jelű transzformánsokat. A transzíormánsok azonosságát AGE-mődszcrreí és restrikciós analízissel tovább bizonyítjuk, a bizonyítást Eckardt módszerével végezzük [Plasmid, 1, 584, (1978)], továbbá Klein és munkatársai módszerével [Plasmid, 3, 88 (1980)]. A transzformánsokat ismert módon tenyésztjük a pJL125 plazmid termelésére és izolálására. 12. példa A pJLl90plazmid előállítása A) A pJL121 plazmid emésztése EcoRI-HindiII enzimmel és a 19,0 kb nagyságú EcoRI-HindiII fragmens izolálása 3 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk az alábbi összetételű reakcióelegyet: 200 pl (80 pg) pJL121 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 30 pl, 1 mg/ml töménységű marha szérum albumin 40 pl, 200 BRL egységet tartalmazó HindllI restrikciós enzim és 30 pl, alábbi összetételű HindllI reakcióelegy: 60 mmól trisz-hidrogén-kiorid, pH=7,5 500 mmól nátrium-klorid 60 mmól magnézium-klorid (literenként). Ezután 10 percen át 65 °C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást. 4 °C hőmérsékletre hűtjük a 30 pl térfogatű reakcióelegyet, majd 110 pl, tízszeres hfgítású, alábbi összetételű HindlIl-EcoRÍ reakcióelegyet adunk hozzá: 382 mmól trisz-hidrogén-kiorid, pH=7,5 50 mmól nátrium-klorid 22 mmól magnézium-klorid (literenként). Ezután 30 pl, 300 BRL egységet tartalmazó EcoRI restrikciós enzim-készítményt adunk az elegyhez, és 3 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubációs idő leteltével 10 percen át 65 °C hőmérsékleten kezeljük a reakcióelegyet, majd 4°C hőmérsékletre hűtjük. Az így kapott 19,0 kb nagyságú EcoRl-HindllI restrikciós fragmenst az előzőekben ismertetett AGE(DE52) elektroeluációs módszerrel izoláljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. B) A pLR4 plazmid emésztése EcoRI-HindlII enzimmel, és a 7,7 kb nagyságú EcoRI-HindlII fragmens izolálása Az emésztést és az izolálást a 12A) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pJL121 plazmid helyett a pLR4 plazmidot használjuk. A kapott 7,7 kb nagyságú fragmenst FE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. 24 C) A pJL121 plazmid 19,0 kb nagyságú EcoRI-HindlII fragmensének és a pLR4 plazmid 7,7 kb nagyságú EcoRI-HindlII fragmensének összekapcsolása A ligálást a 8C) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az SCP2* plazmid 6,0 kb nagyságú Sál! és a pBR325 plazmid Sail fragmense helyett a pJL121 plazmid 19,0 kb nagyságú EcoRI-HindlII és a pLR4 plazmid 7,7 kb nagyságú EcoRI-HindlII fragmensét használjuk. A kapott ligáit dczoxi-ribonuklemsav tartalmazza az előállítani kívánt pJL190 plazmidot, ezt felhasználásig 4 "C hőmérsékleten tároljuk. A pJL190 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 4. ábrán adjuk meg. A restrikciós térképet olyan plazmáddal határoztuk meg, amelyet E. coli K12 ;'7600Rk—Mt sejtekbe transzformáltunk. 13. példa Az E. coli KI2 C600Rk—Mk/pJL190 előállítása Az előállítást a 7. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pJL120 és a jiIL121 plazmidok helyett a pJL19ü jelű plazmidot használjuk. A kapott telepeket a várt fenotípusra (AmpR, Tets) szelektáljuk, és a 11. példában megadottak szerint vizsgáljuk, amikor megkapjuk az E. coli KI2 C600Rk—Mk/pJL190 transzformánsokat. A transzformánsokat ismert módon tenyésztjük a l JL19Ü plazmid termelésére és izolálására. 14. példa A pJLl 92 plazmid izolálása A pJL192 plazmid 10 pg/ml koncentrációjú neomicinre biztosít rezisztenciát, a plazmidot könnyen izolálhatjuk az E. coli K12 C600Rk—Mk/ IJL192 sejtekből. E törzset 15040 számon letétbe helyeztük a Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois törzsgyűjteményébe. A {JL192 plazmid restrikciós térképe nem I iilönböztethető meg a 4. ábrán megadott pJL190 plazmidétól. 15. példa A pJL195 plazmid előállítása A) A pJL125 plazmid EcoRI-Sáli emésztése és az 5,4 kb nagyságú EcoRI-Sall fragmens izolálása Ázz emésztést és izolálást a 12A) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
