197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
25 197 044 26 hogy a pJLl21 plazmid helyett a pJL125 plazmidot használjuk, és az emésztést nem HindiII restrikciós enzimmel és az ehhez tartozó reakcióeleggyel, hanem Sáli reakcióeleggyel és restrikciós enzimmel végezzük. Ezenkívül az alábbi összetételű Sall-EcoRI hígítót használjuk: 940 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5 55 mmól inagnézium-klorid (literenként). A kapott 5,4 kb nagyságú EcoRI-Sall fragmenst TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. D) A pLR4 plazmid emésztése EcoRI enzimmel és részleges hasítása Sáli enzimmel, valamint a 7,5 kb nagyságú EcoRI-részleges Sail fragmens izolálása A Sáli emésztést a 10A) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pJL121 plazmid helyett a pLR4 plazmidot használjuk. Mivel az Sail enzimmel csak részleges emésztést végzünk, a reakcióelegyet először 15 percen át 37 °C, majd 10 percen át 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 4 °C hőmérsékletre hűtjük az elegyet, és a kapott 7,7 kb nagyságú részlegesen emésztett Sáli lineáris fragmenst AGE(DE52) elektroeluciós módszerrel izoláljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat TE-pufferban oldjuk, és EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk a 6A) példában megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy az SCP2* plazmid helyett az előzőek szerint előállított fragmenst használjuk. A kapott 7,5 kb nagyságú EcoRI-Sall fragmenst (a lehető legnagyobb EcoRI-Sall fragmens) az előzőek során ismertetett AGE(DE52) elektroeluciós módszerrel izoláljuk. A terméket TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. C) A pJLI25plazmid 5,4 kb nagyságú EcoRI-Sall fragmensének és a pLR4 plazmid 7,5 kb nagyságú EcoRI-részleges Sáli fragm ensének összekapcsolása A ligálást a 8C) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az SCP2* plazmid 6,0 kb nagyságú Sail fragmense és a pBR325 Sail fragmense helyett a pJL125 plazmid 5,4 kb nagyságú EcoRI-Sall fragmensét és a pLR4 plazmid 7,5 kb nagyságú EcoRI-részleges Sáli fragmensét használjuk. A kapott ligáit dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a pJL195 plazmidot, amit felhasználásig 4 "C hőmérsékleten tárolunk. A pJL195 plazmid restrikciós térképét a mellékelt 5. ábrán adjuk meg. A restrikciós térképet E. coli KI2 C600Rk—Mk— sejtekből izolált plazmiddal határoztuk meg. 16. példa Az E. coli KI 2 C600Rk—Mk—/pJL195 előállítása A kísérletet a 7. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pJL120 és a pJL121 plazmidok helyett a pJL195 plazmidot használjuk. A kapott telepeket a várt fenotípusra (AmpR, Tets) és tulajdonságra (lásd 11. példa) vizsgáljuk, amiután megkapjuk az E. coli K12 C600Rk—Mk—/pJL195 transzformánsokat. A transzformánsokat ismert módon tenyésztjük a pJL195 plazmid előállítására és izolálására. 17. példa A Streptomyces griseofuscus/pJL120 előállítása AJ A tenyészet növesztése protoplasztok képzéséhez Vegetatív inokulum előállítására a törzset sülylyesztett, fermentációs körülmények között tenyésztjük 0,4% glicinnel kiegészített TSB táptalajon, 20 órán át, 30 °C hőmérsékleten. A tenyészetet homogenizáljuk, és 1/20 hígításban, hasonló összetételű táptalajra oltjuk, majd 18 órán át 30 °C hőmérsékleten tenyésztünk. B) Transzformálás 20 pg pJL120 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat és 1X109 Streptomyces griseofuscus protoplasztot használva elvégezzük a transzformációt, gyakorlatilag az International Patent Application No. PCT/ 6379/00095; No. W079/01169 leírás 2. példája szerint eljárva. A Streptomyces griseofuscus törzset letétbe helyeztük az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland állandó törzsgyűjteményében ATCC 23916 számon. C) Szelekció A transzformáció mérésére még alacsony frekvencia esetén is két módszert használunk. 1) Pock-mérés: A regenerált protoplasztokból képződő zavaros réteg a regenerációs lemezeken spórákat tartalmaz, ezeket összegyűjtjük. Úgy járunk el, hogy 10 ml-es steril desztillált vizet adunk a lemezre, és a tenyészet felületét a spórák eltávolítására egy kaccsal óvatosan kaparjuk. A kapott spóraszuszpenziót 10 percen át percenként 20.000-et forduló rotorban centrifugáljuk. A felülúszót ki öntjük, és az üledéket 0,3 ml 20%-os glicerinben szuszpendáljuk. 10~5 hígításig sorozat-hígításokat készítünk oly ■módon, hogy 0,1 ml spóraszuszpenziót 0,9 ml 20%-os glicerin-oldattal hígítunk. Ezután —20 ”C hőmérsékleten tároljuk a készítményt, amikor az élőképcsség enyhén csökken. A hígításokból (például 10_1, 10-2, 10~4) 0,1 ml-nyi mennyiségeket R2 táptalajra juttatunk [Hopwood és Wright, Mo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
