197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
3 197043 4 nukleinsavat juttatunk egy befogadó gazdasejtbe, ezáltal változik a genotípus, és így öröklődő változás következik be a befogadó sejtben. A transzformáns olyan befogadó sejt, amelyet transzformáltunk. Represszor alatt olyan gént értünk, amely egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektoron helyezkedik el, és amely egy letális vagy kondicionálisan letális, a gazdasejt kromoszómájában lévő gén kifejeződését represszálja és akadályozza meg. A funkcionális polipeptid alatt kinyerhető, biológiailag aktív, heterológ polipeptidet vagy prekurzort, kinyerhető, biológiailag aktív, heterológ polipeptidből álló polipeptidet és egy homológ polipeptid egy részét vagy teljes egészét, egy kinyerhető, biológiailag inaktív fúziós, heterológ polipeptidből és egy biológiailag inaktív, homológ polipcptidből álló polipeptidet értünk, amely specifikusan hasítható; ide tartoznak továbbá azok a biológiailag aktív polipeptidek is, amelyek jelenléte kimutatható. A fuzionált géntermék olyan kinyerhető, heterológ polipeptid, amely fuzionálva van egy homológ polipeptid részével vagy teljes egészével. A marker egy gén vagy génkombináció, amelynek funkciója ismert, és amely egy kromoszómán, rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektoron vagy víruson helyezkedik el. Apr:ampicillin rezisztens fenotípus. Apkampicillin érzékeny fenotípus. Tcr: tetraciklin rezisztens fenotípus. Te5: tetraciklin érzékeny fenotípus. Ahogy azt a fentiekben megadtuk, a találmány szerinti eljárással rekombináns dezoxi-ribonukleinsav által meghatározott termékek előállítására sejteket tenyésztünk. Hatékonyan működő szelektív rendszer nélkül az ilyen tenyészetek sejtjeinek nagy része elveszti az adott plazmidot, és így az adott termék termelése jelentősen csökken. A találmány szerinti eljárás nem csak azt biztosítja, hogy gyakorlatilag az összes tenyészetben jelen lévő sejt hordozza a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektort, de az eljárás biztosítja azt is, hogy a gén kifejeződése fokozódjon, és így nagyobb mennyiségű funkcionális polipeptid bioszintetizálódik. így a találmány szerinti eljárás különösen előnyös, és az eddidi eljárásokkal szemben biztosítja a plazmidszegregálódás kiküszöbölését, a génkifejeződés fokozott mértékét és a funkcionális polipeptid jelentősen nagyobb mennyiségben való termelését. A találmány szerinti eljárás igen rugalmasan alkalmazható, mivel bármely olyan termék előállításakor alkalmazható, ahol a szintézist rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó plazmid határozza meg. Mivel a találmány szerinti eljárás használhatósága független a funkcionális polipeptidet kifejező génektől, a találmány szerinti eljárást használhatjuk egy vagy több gyakorlati értékkel rendelkező gént hordozó rekombináns törzsek esetén. Ezenfelül az előzőekben leírt génkifejeződést elősegítő eljárást nem korlátozzuk bármely adott géntermékre. így a találmány szerinti továbbfejlesztett módszer előnyösen használható bármely funkcionális polipeptid vagy géntermék rekombináns detoxi-ribonuklemsav-tschnikával való előállítása során. A rekombináns dezoxi-ribonukleínsavat hordozó gazdasejtek fenntartására és stabilizálására felhasználható sejtönpuszlítást a lambda bakteriofág és az E. coli K12 rendszeren szemléltetjük. A lambda .bakteriofág egy temperált fág, amely E. coli K12 sejteket fertőzve két cikluson megy át. A lírikus fázisban a bakteriofág dezoxi-ribonukleinsava autonóm replikálódik, szabályozza a bakteriofág komponenseinek szintézisét és összeállását, és ezután elpusztítja a sejtet, amikor az érett bakteriofágok elszabadulnak. A lizogén fázisban a bakteriofág beépül a gazdasejt kromoszómájába, ez a profág, ekkor a kromoszómában markerként replikálódik cs nem következik be a bakteriofág komponenseinek szintézise. A lambda cl bakteriofág gén egy olyan represszor szintézisét határozza meg, amely ’ehetővé teszi a lizogén állapot fenntartását, és gátolja a bakteriofág komponenseinek szintézisét meghatározó gének kifejeződését és a fág érését, la a represszort inaktiváljuk, vagy eltávolítjuk a sejtből, a profág kiszakad a kromoszómából, belép a lírikus ciklusba, és megöli a sejtet. A sérült lambda cl gént tartalmazó bakteriofág nem képes a lizogén állapotot fenntartani, és letális a sejtre nézve, kivéve, ha egy másik forrásból származó, funkcionális represszort biztosítunk. A találmány szerinti eljárás egy szemléltető kivitelezési változatában a lambda cI90-et használjuk represszortól függő profágként, és egy olyan cl gént alkalmazunk, amely egy restrikciós fragmenst tartalmaz, és amelyet egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektorba klónozunk, és így ez funkcionális represszorként viselkedik. Részletesebben szólva, a találmány szerinti továbbfejlesztett és felhasználható szelektív rendszer szemléltetését úgy végezzük, hogy a trpE-inzulin A láncát meghatározó gént hordozó p!A7A4Al plazmád 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós f agmensét klónozzuk egy új, pPR12 plazmádba. Ezt úgy végezzük, hogy kivágjuk a pPR12 plazmid C,4 kb nagyságú EcoRI-BamHI szegmensét. A IPR12 plazmid általánosan használható vektor, rúvel a pIA7A4Al plazmid 1,3 kb nagyságú restr kciós fragmens helyére bármely adott dezoxi-ritonukleinsav-fragmenst beépíthetünk. A pPR12 plazmid előállítására a pPR3 plazmid 0,9 kb nagyságú Psll-Hincll restrikciós fragmensét, amely tartalmazza a lambda c!857 bakteriofág represszort, beépítjük a pBR322 plazmidba. A pPR3 plazmid előállítására a lambda c!857 bakteriofág 2,5 kb nagyságú BgUI fragmensét beépítjük a plB7A4Al plazmid egyetlen BamHI restrikciós helyére. A lambda cI857 bakteriofág 2,5 kb nagyságú BgUI restrikciós fragmense a cl represszor génen kívül tartalmazza a rcx gént, és a cro gén egy részét is. Úgy tapasztaltuk, hogy meglepő módon, ha a cl represszor. gént tartalmazó restrikciós fragmensből kihasítjuk a cro gént és a rex gén legnagyobb részét, úgy nagymértékben növekszik és fokozódik a genetikai kifejeződés, és így a funkcionális polipcptiJ termelése. A találmány szerinti eljárás szemléltetése során bemutatott hasított, lambda cl-t tartalmazó és cro és rex törölt restrikciós fragmensek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
