197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
5 i 197 043 6 közül különösen előnyös a pPR3 plazmid 0,9 kb nagyságú Pstl-HincJI restrikciós fragmensc. Az 1—4. mellékelt ábrákon sorrendben bemutatjuk a pIA7A4Al, pIB7A4Al, pí’R3 és pPR12 plazmidok restrikciós és funkcionális térképét. A pIA7A4Al plazmid tartalmazza az E. coli triptofán promoteijét, antibiotikum rezisztencia markereket és egy olyan gént, amely kifejez egy, az E. coli trpE protein és a humán inzulin A poüpeptid láncából álló fuzionált génterméket. A plB7A4Al plazmid hasonló az előzőhöz, azzal a különbséggel, hogy a fuzionált génterrnéket kifejező gén tartalmazza a trpE protein egy részét fuzionálva az A helyett a B humán inzulin poíipeptid lánccal. A pIA7A4Al plazmid a pBR322 plazmidból származik, és az 1A-J. példában megadottak szerint állítjuk elő. A konvencióknak megfelelően a „A” jel deléciót jelez így például az. „AEcoRl-Xbal” kódszám azt a plazmidot jelenti, amelyből restrikciós enzimekkel eltávolítottuk az EcoRI és Xbal restrikciós helyek által felismerhető helyek között lévő nukleotid-szekvenciát. Kényelmi szempontból bizonyos deléciókat számokkal jelzünk. így például a pBR322 szűlőpíazmid tetraciklin rezisztenciát meghatározó génjét megelőző EcoRI felismerési hely első bázispátjából (BP) kezdődően a A1 jel azt jelenti, hogy az 1—30: bázispár (azaz AEcoRIHindlII) kiesett, és így a tetraciklin promoter/operátor rendszer kihasadt; a A2 jel az 1—375. bázispár (azaz a AEcoRl-BamHl) deiécióját jelenti, és így nincs jelen a tetraciklin promoter/operátor rendszer és a tetraciklin rezisztenciát meghatározó struktűrgén egy része; a A4 jel azt jelenti, hogy a 900—1500. bázispár közötti szakasz kihasadt a trp operon fragmensből, így nincs jelen a trp D polipeptid siruktúrgénje. Ha a pIA7A4Al plazmid 1,3 kb nagyságú, trp E-inzulin A láncot meghatározó gént hordozó EcoRI-BamHI restrikciós fragmensét klónozzuk a pPR12 plazmid 4,7 kb nagyságú EcoRI-BamHI iestrikciós fragmenséhez, amelyet a következőkben pPR12A2 jellel jelölünk, úgy az új pPR17 plazmidot kapjuk. A pIA7A4Al plazmid 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmense tartalmazza a A2 egy részét; így a klónozáskor visszaáll a A2-AI szekvencia. A pPR17 plazmid tartalmazza a lambda CÍ857 bakteriofág 0,9 kb nagyságú Pstl-Hinclí restrikciós fragmensét, és így lizogenizált gazdasejtekben gátolja a lambda bakteriofág Etikus kifejlődését. Ezenkívül a pPR17 plazmid meghatározza és kifejezi az előzőekben ismertetett trp E-inzulin A lánc fuzionált géntermékét, a kifejeződés mértéke pedig lényegesen nagyobb, mint más, az irodalomból ismert lambda cl gént hordozó más plazmidok esetében. A pPR17 plazmid funkcionális és restrikciós térképét a mellékelt 5. ábrán adjuk meg. Az pPR17 rekombináns plazmid E. coli sejtekbe transzformálható, például az E. coli K12 294 [Goeddel és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 7<5, 106 (1979)j, E. coli K12 RV308 [Mauer és munkatársai, J, Mol. Bioi., 139, 147—161 (1980)], E. coli K12 C600 [Bachman, Bacterioi. Rév., 36, 526-557 (1972)], E. coli K12 C600Rk- Mt— [Chang és Cohen, Proc. Nat. Acad. Sei.. 71, 1030—1034 (1974)], és más sejtekbe, majd a kapott törzseket bármilyen lambda bakteriofággal lizogenizálhatjuk, amely íágok nem termelnek funkcionális cl represszort, ilyen például a lambda cl9ü bakteriofág. így az előállított E. coli K122941ambdacl9Ü/pPR17, E. coli K12 RV3081ambdací90/pPR17, E. coli K12 C6001ambdaci9Ö/pPR17 és az E. coli K12. C600Rk-Mk-lambdad90/pPR17 sejtek a pPR17 plazmid megtartását igénylik, ugyanakkor az előállított E. coli K12 294/pPR17, E. coli K12 RV308/pPR17, E. coli K12 C60Ü/pPR17 és az E. coli K12 C600R2-Mk-/pPR17 sejtek plazmid nélkül is túlélők. A törzsek plazmidmegtartási képességének összehasonlításakor világosan kiderül, hogy gyakorlatilag az összes élő sejt a találmány szerinti eljárással előállított törzsek esetén tartalmazza a plazmidot. Az E, coli K12 294!amlxlaci90/pPR17, E. coli K12 RV3081ambdacl9Ü/ pPR17, és az E. coli K12 C6001ambdacI90/ pPR17, valamint az E. coli K12 C600RK -Mk-lambdacl90/pPR17 sejtek ezenkívül nemcsak megtartják a pPR17 plazmidot, de termelik az adott fuzionált génterméket is. A találmány szerinti továbbfejlesztett szelektív rendszer és ennek felhasználása szemléltethető olymódon is, hogy a trp E-inzuiin B láncot meghatározó gént tartalmazó p!B7A4Al plazmid 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmenst klónozzuk a pPR17 esetén megadott módon a pPRÍ2 plazinidba. A pIB7A4Al plazmid a pBR322 plazntidból származik a plA7A4Al plazmid esetén megadottakhoz hasonlóan. A pI87A4Al plazmid előállítását az alábbiakban a 2. példában ismertetjük. A plB7A4Al plazmid 1,3 kb nagyságú, EcoRIBamHI tip E-inzulin B láncot meghatározó gént hordozó restrikciós fragmensének klónozása a pPR12 plazmid 4,7 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmenséhez az új pPR18 plazmidot eredményezi. A pPR18 plazmid tartalmazza a lambda c!857 bakteriofág G,9 kb nagyságú Pstl- Hincll restrikciós fragmensét, és így a lizogenizált gazdasejtekben gátolja a lambda bakteriofág litikus fejlődését. Azonkívül a pPR18 plazmid meghatározza és kifejezi az előzőekben ismertetett trp E-inzulin B lánc fuzionált génterrnéket, mégpedig az irodalomból ismert lambda cl géni tartalmazó plazmidokhoz képest jelentősen nagyobb mértékben. A pPR18 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 6. ábrán mutatjuk be. Az új pPR18 rekombináns plazmidot E. coli sejtekbe transzformálhatjuk, például az alábbiakban: E. coli K12 294, E. coli K12 RV308, E. coli X12 C600, E. coli K12 C600Rk-Mk- és mások. A kapott törzseket bármilyen olyan lambda bakteriofággal lizogenizálhatjuk, amelyek nem tartalmaznak funkcionális cl represszort, például a lambda cI90 bakteriofággal. így, ahogy azt a pPR17 lizogenizált törzsek esetén megadtuk, az előállított E. coli K12 294 Iambdac!90/pPR18, E. coli K12 RV308IambdncI90/pPRl8, E. coli K12 C60()lnmbdac!90/ pPR18 és az E. coli K12 C6(K)Rk-Mk-lambducl90/ pPR18 törzsek Igénylik a pPR18 plazmid megtartását, ugyanakkor az E. coli K12 294/pPR18, E. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
