197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
2 7 197043 28 a iambdaKH54biambda és a lai»bdaKH54h80 iágokkal szembeni immunitást. 42 °C hőmérsékleten határozzuk meg a lambdaKH54híambda és a lambdaKH54h80 bakteriofágokkal szembeni érzékenységet. Eev íranszformánst szelektálunk, és E coli K12 CőOORk-M^/nPRlS kódszánunal jelöljük. Ezt a túlélő telepet a várt fenotfpusra vizsgáljuk, és felhasználjuk a pPR18 plazmid sokszorosítására és izolálására. 14. példa A pPR17 plazmid transzformálása az E. coli K12 294 sejtekbe A találmány szerinti plazmídokat módosítjuk a K-restrikciós rendszerre! széniben oly módon, hogy E. coli K12 294 sejtekbe transzformáljuk. Az E. coli K12 294 Rk-Mk+, így transzformációt követően a nem módosított dezoxi-ribonukleinsav plazmid módosul és rezisztenssé válik Rj.+Mk+ specificitásü törzsek restrikciós hatásával szemben. így az E. coli K12 294 íranszformánsokat felhasználjuk a találmány szerinti plazmidok sokszorosítására és izolálására az ezt követő Rfc+Mk+ E, coli transzformálásokhoz. Ilyen törzs például az E. coli K12 RV3Ü8. A transzformációt a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 O600Rk-Mk-sejtek helyett az E. coli K12 294 sejteket használjuk, és a pPR3 plazmid helyett pedig a pPR17 plazmidot, A transzformánsokat Tcr fenotfpusra szelektáljuk. A rekombinánsok Ap* és Tcr fenotípusát bizonyítjuk, és 32 °C-on megállapítjuk lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 immunitásukat, illetve 42 °C hőmérsékleten a lambdaKH54híambda és a lambdaKH54h80 bakteriofágokkal szembeni szenzitiyitásukat. A transzformánsok 100%-os genetikai kapcsolatot mutatnak a plazmidon lévő markerek tekintetében. Egy transzformánst szelektáltunk és E. coli K12 294/pPR17 jellel jelöltünk. A telep várt fenotípusát vizsgáljuk, és felhasználjuk a pPR17 plazmid sokszorosítására és izolálására. 15. példa A pPR17 piazmid sokszorosítása és izolálása A pPR17 plazmid sokszorosítását és izolálását az 5. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 294/pPR17 törzset használjuk. 16. példa A pPR!8 plazmid transzformálása az E. coli K12 294 sejtekbe A transzformációt a 14. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pPR17 plazmid helyett a pPR18 plazmidot használjuk. A pPR18 plazmid sokszorosítása és izolálása A pPR18 plazmid sokszorosítását és izolálását az 5. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 294/pPR18 törzset használjuk. 17. példa 18. példa A pPR!7 plazmid transzformálása az E. coli K12 RV308 sejtekbe A transzformációt a 14. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 15. példában megadottak szerint előállított pPR17 plazmidot és az E. coli K.12 RV308 sejteket használjuk. 19. példa A pPR18 plazmid transzformálása az E. coli K12 RV308 sejtekbe A transzformációt a 14. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 17. példában megadottak szerint előállított pPRI8 plazmidot és az E. coli K12 RV308 sejteket használjuk. 20. példa Az E. coli K12 RV308!ambdacl90/pPR17 törzs előállítása lambdac!90-nel való lizogenizálással A 18. példában megadottak szerint előállított E. coli K12 RV308/pPR17 törzset 32 *C hőmérsékleten növesztjük mindaddig, míg 35 Klett-egységet nem érünk el, ezután 60 percig 45 “C hőmérsékleten tartjuk a tenyészetet. A sejteket lambdacl90 fágokkal fertőzzük (20 frtg/sejt) és 40 percen át 45 “C hőmérsékleten inkubálunk. A telepeket 32 °C hőmérsékleten növesztjük olyan L-agaron, amely ml-enként 10 pg tetraciklint tartalmaz. A kapott E. coli K12 RV308IambdacI90/'pPR17 telepeket 32 °C hőmérsékleten való növekedési képességük és 42 'C hőmérsékletre való érzékenységük alapján vizsgáljuk. 21. példa Az E. colt K12 RV3081ambdacl90/pPR18 előállítása A kísérletet a 20. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 RV308/pPR17 helyett a 19. példában megadottak szerint előállított E. coli K12 RV308/ pPR18 sejteket használjuk. 5 10 15 20 25 30 35 4Q 45 50 55 60 65 15
