197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
29 197043 30 22. példa Az E. coli K12 C600Rk-Mk-lambdacI90/pPR12 előállítása A kísérletet a 20. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az E. coli K12 RV308/pPR17 helyett a 7. példában megadottak szerint előállított E. coli K12 C600Rk-Mk/pPR12 törzset használjuk. Az előzőekben megadottak szerint még az alábbi törzseket állítjuk elő: 23. E. coli K12 C600/pPR17 24. E. coli K12 C600/pPR18 25. E. coli K12 RV308/pPR12 26. E. coli K12 RV3081ambdacl90/pPR12 27. E. coli K12 C6001ambdacI90/pPR17 28. E. coli K12 C600IambdacI90/ppR18 29. E. coli K12 294 lambdacI90/pPR17 30. E. coli K12 294 lambdac!90/pPR18 31. E. coli K12 C600Rk-Mk-lambdacI90/pPR17 32. E. coli K12 C600Rk-Mk-lambdacI90/pPR18. Rekombináns plazmidokat tartalmazó gazdasejtek stabilitásának meghatározása szelekcióval és anélkül A plazmidot tartalmazó sejtek frekvenciájának mérésére a rekombináns plazmidokon lévő Tcr gént használjuk fel. A tenyészet sorozathígításait 10 pg/ ml tetraciklint, illetve antibiotikumot nem tartalmazó L-agarra szélesztjük, és a tenyészeteket 32 ‘C hőmérsékleten növesztjük. A plazmidf sejtek frekvenciáját úgy határozzuk meg, hogy viszonyítjuk a tetraciklinre rezisztens telepek számát a tetraciklint nem tartalmazó L-agaron növekvő telepek számához. Eljárhatunk úgy is, hogy az L-agaron növekvő telepeket replikázzuk 10 pg/m! tetraciklint tartalmazó L-agarra, és a tenyészeteket 32 °C hőmérsékleten növesztjük. A pkizmid+ sejtek frekvenciáját úgy határozzuk meg, hogy a tetraciklinre rezisztens telepek számát viszonyítjuk az L-agaron tetraciklin nélkül növekvő telepek számához. Az E. coli K12 RV308/plA7A4Al és az E. coli K12 RV3()8Iambdac!90/pPR17 törzsekkel kapott eredményeket a 11. táblázatba adjuk meg, a 111. táblázatban ismertetjük az E. coli K12 RV308/plB7A4Al és az E. coli K12 RV3081ambdacI90/pPR18 tenyészetekkel kapott eredményeket, míg a IV. táblázatban megadjuk az E. coli K12 C600Rk-Mk-/pPR12 és az E. coli K12 C600Rk-Mk-lambdac!90/pPR12 törzs eredményeit. II. táblázat Rekombináns plazmidok stabilitása Osztódások száma A plazmid megtartásának százaléka E. coli K12 E. coli K12 RV308/ RV3081ambda-PIA7A4A1 cI90/pPR17 9 96 100 30 95 100 III. táblázat Rekombináns plazmidok stabilitása Osztódások A plazmid megtartásának száma százaléka E. coli K12 E. coli K12 RV3Ü8/ RV3081ambda-PIB7A4A1 cl9ü/pPR18 9 96 100 30 79 100 IV. táblázat Rekombináns plazmidok stabilitása Osztódások A plazmid megtartásának száma százaléka E. coli K12 E. coli K12 ' C600Rt-Mt-/ C600R„-Mt-/ pPR12 !ambdacI90/ pPR 12 33 87 100 A II—IV. táblázatokba megadott eredmények világosan szemléltetik, hogy a találmány szerinti szelektív rendszer hatékony baktériumpopulációkban való rekombináns plazmid fenntartása szempontjából. Az E. coli K12 RV308/pIA7A4Al tenyészet sejtjeinek 5%-a, az E. coli K12 RV308/pIB7A4Al tenyészet sejtjeinek 21%-a plazmid mínusz 30 osztódást követően. Ugyanakkor a szelektív rendszerrel rendelkező E. coli K12 RV3ü81ambdacI90/ pPR17 és az E. coli K12 RV3081ambdacl90/ pPR18 tenyészetek egyik sejtje sem plazmid mínusz. Az E. coli K12 C600Rk-Mk-lambdacI9ü/ pPR12 tenyészet plazmid stabilizása szintén kitűnő. Az E. coli K12 C600Rk-Mk-/pPR12 tenyészet sejtjeinek 13%-a plazmid mínusz 33 osztódást követő-5 10 15 20 26 30 35 43 45 60 55 '30 65 16
