197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
25 197043 26 A pPR12 plazmid sokszorosítása és izolálása A pPR12 plazmicl sokszorosítását és izolálását az 5. példában megadottak szerint végezzük. 8. példa 9. példa A pPR17 plazmid előállítása A) A lambda cl gént és egy replikont tartalmazó pPR12 plazmidból származó 4,7 kb nagyságú EcoRI-BamHI lineáris fragmens izolálása A 8. példában megadottak szerint előállított pPR12 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 150 pl-ét (20 pg), 20 pl 1 OX BamHJ-puffert (200 mmól/i trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,0, 1 mol/1 nátriumklorid, 70 mmól/1 magnézium-klorid, 2 mmól/1 2-merkapto-etanol), 2 pl (20 egység/pl) BamHI restrikciós enzimet és 28 pl vizet inkubálunk 30 percen át, 37 “C hőmérsékleten, majd 1,3 órán át szobahőmérsékleten, végül 65 °C hőmérsékleten, 5 percen át. 4 °C hőmérsékletre hűtjük a reakcióelegyet, 4 pl (10 egység/pl) EcoRI restrikciós enzimet adagolunk. A kapott reakcióelegvet 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, amiután megkapjuk a 4,7 kb nagyságú restrikciós íragmenst. A fragmenst poliakrilamid gél-elektroforézissel és elektroelucióval izoláljuk, a kapott dezoxi-ribonukleinsavat TE-pufferban szuszpendáljuk, és felhasználásig —4 ”C hőmérsékleten tároljuk. B) A triptofán 1’ E’ és a humán inzulin A láncát tartalmazó fúziós polipeptidet meghatározó gént hordozó, pIA7A4Al plazmidból származó 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI lineáris fragmens izolálása Az izolálást a 9A) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pPRI2 plazmid helyett a pIA7A4Al plazmidot használjuk. Ezenkívül az EcoRI restrikciós enzimmel csak félórán át végezzük a reakciót, mivel részleges EcoRI emésztésre van szükségünk. A dezoxi-ribonukleinsavat poliakrilamid gél-elektroforézissel, elektroelúcióval és kicsapással izoláljuk, és az így kapott 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmenst az alábbi ligációs reakcióban azonnal felhasználjuk. C) Az inzulin fuzionált génjének és az EcoRI és BamHI végekkel rendelkező lineáris pPR12 dezoxí-ribonukleinsav-fragmens ligálása A 9A) példában megadottak szerint előállított 1,5 pg-nyi mennyiségű, 4,7 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot és a 9B) példában megadottak szerint előállított 1,5 pg mennyiségű, 1,3 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsavat elegyítünk, és kétszer etanollal kicsapjuk. A csapadékot 6 pl vizet és 2 pl 5X-ligációs puffert tartalmazó elegyben oldjuk, és ezután 10 percen át 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubációt követően 15 °C-ra hűtjük az elegyet, és 2 pl, 0,66 mmól/i koncentrációjú ATP-oldatot és 0,1 pl (1 egység/pl) T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adagolunk. A ligációs reakciót 15 °C hőmérsékleten végezzük 18 órán át, amiután megkapjuk a pPR17 plazmidot. 10. példa A pPR17 plazmid transzformálása E. coli K12 C600Rx-Mk-sejtekbe A transzformációt a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pPR3 plazmid helyett a pPR17 plazmidot használjuk. A transzformánsoknt 32 *C hőmérsékleten lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 bakteriofágokkal szembeni immunitásuk alapján szelektáljuk. A rekombinánsok Ap" és Te7 fenotfpusát bizonyítjuk, 32 °C hőmérsékleten vizsgáljuk lambdaKH54hlambda és !ambdaKH54h8ü immunitásukat, illetve 42 °C hőmérsékleten bizonyítjuk lambdaKH54hiambda és lambdaKH54h8ü bakteriofágokkal szembeni érzékenységüket. Egy transzformánst szelektálunk, és E. coli K12 C600RK-Mj./ pPR17 jellel jelöljük. Ezt a túlélő telepet vizsgáljuk a várt fenotípusra, és a pPR17 plazmid sokszorosítására és izolálására használjuk fel. 11. példa A pPR17 plazmid sokszorosítása és izolálása A pPR17 plazmid sokszorosítását és izolálását az 5. példában megadottak szerint végezzük. 12. példa A pPR18 plazmid előállítása Az előállítást a 9A(—9C) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pIA7A4Al plazmid helyett a pIB7A4Al plazmidot használjuk az 1,3 kb nagyságú EcoRI-BamHI restrikciós fragmens elkészítéséhez. 13. példa A pPR18 plazmid transzformálása az E. coli K12 CóOOI^-M^-sejtekbe A transzformációt a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a -pPR3 plazmid helyett a pPR18 plazmidot használjuk. A transzformánsokat 32 °C hőmérsékleten, a lambdaKH54hlambda és a lambdaKH54h8ü bakteriofágokkal szembeni immunitás alapján szelektáljuk. A rekombinánsok Ap" és Te7 fenotfpusát bizonyítjuk, és meghatározzuk 32 °C hőmérsékleten 5 10 15 20 25 30 36 40 45 50 65 60 65 14
