197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
23 197043 24 A pPR12 plazmid előállítása A) Lineáris, Pstl és Hindi végekkel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó lambda cí gén izolálása Az 5. példában megadott módon előállított 70 (ig mennyiségű pPR3 plazmidot 70 pl alábbi összetételű ÍOX Pstl-pufferba oldunk: 200 mmdl/l trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,5, 100 mmó!/l magnézium-klorid, 500 mmdl/l ammónium-szulfát. Az oldathoz 50 pl, 1 mg/ml koncentrációjú marhaszérum albumin-oldatot és 555 pl vizet adunk, majd 15 percen át 65 'C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután 25 pl (1 egység/ pl) Pstl restrikciós enzimet adagolunk, ás a kapott reakcióelegyet 4,5 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott Pstl restrikciós fragtnenseke ismert módon izoláljuk poliakrilamid gél-elektroforézissel. Mivel a pPR3 plazmid két Pstl restrikciós helyet tartalmaz, teljes Pstl emésztést követően egy 3,6 kb nagyságú fragmenst és egy 4,2 kb nagyságú fragmenst kapunk. Az utóbbi fragmens tartalmazza a számunkra érdekes lambda cl bakteriofág gént. így a 4,2 kb nagyságú fragmenst a fentiekben megadott módon izoláljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav üledék tartalmazza a számunkra fontos 4,2 kb nagyságú restrikciós fragmenst, így ezt az üledéket 50 pl TE- pufferban szuszpendáljuk. A dezoxi-ribonukleinsav szuszpenziót ezután 15 percen át 65 *C hőmérsékleten inkubáljuk, majd felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. 50 pl fenti, 4,2 kb nagyságú Pstl restrikciós fragmenst, löm pl 1 ÖX HincII-puffert (100 rnmól/i trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,9, 600 mmól/1 nátrium-klorid, 66 mmól/1 magnézium-klorid, 10 mmól/1 ditio-treitetol), 38 pl vizet és 2 pl, 10 egység/pl töménységű Hindi restrikciós enzimet elegyítünk, és az elegyet 20 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 5 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk. 20 ’C hőmérsékletre hűtjük az elegyet, és ezután 200 pl TBE-oldatot adagolunk, és a restrikciós fragmenseket poliakrilamid gélelektroforézissel izoláljuk. A kapott 0,9 kb nagyságú Pstl-HincII restrikciós fragmens tartalmazza a lambda cl bakteriofág gént. A terméket 10 pl TE- pufferban oldjuk és 4 °C hőmérsékleten tároljuk. 6. példa B) A Hindi és a Pstl végekkel rendelkező lineáris dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó td gén és egy replikon izolálása 100 100 pl (3,2 pg) pBR322 plazmidot, 15 pl 1 OX HincII-puffert, 34 pl vizet és 1 pl (10 egység/pl) Hindi restrikciós enzimet elegyítünk, és az elegyet 37 °C hőmérsékleten, 20 percen át inkubáljuk. Ezután 5 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk. 4 °C- ra hűtjük a reakcióelegyet, és a 3. példában megadottak szerint eljárva, etanollal kicsapjuk. A kapott Hindi enzimmel részlegesen emésztett pBR322-t az alábbi oldatban szuszpendáljuk: 10 pl 1 OX Pstl-puffer, és 79 pl víz. A kapott szuszpenziót 5 percen át 65 *C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 4 ’C-ra hűtjük. Ezután 10 pl, 1 mg/ml töménységű boíjúszérum-albumint és 2 pl Pstl restrikciós enzimet (10 egység/ml) adagolunk. A kapott reakcióelegyet 1 órán át 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 5 percen át 65 ‘C hőmérsékleten tartjuk, végül 4 °C hőmérsékletre hűtjük. A kapott Hindl-Pstl restrikciós fragmenst ismert módon izoláljuk poliakrilamid gél-elektroforézisseí. Az elektroelűcióval kapott dezoxi-riboruklcinsavat TE-pufíerban oldjuk, és felhasználásig * °C hőmérsékleten tároljuk. C) A lambda cl gént tartalmazó fragmens és a Pstl és Hindi végekkel rendelkező lineáris pBR322 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens ligálása 10 pl (1,8 pg), a 6A) példában megadottak szerint előállított 0,9 kb nagyságú HinclI-Pstl fragnienst, 10 pl (0,9 pg) 4 kb nagyságú, a 6B) példában megadottak szerint előállított Pstl-HinclI-fragnensf elegyítünk, és kétszer etanollal kicsapunk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 2 pl 5X-ligációs pufferban oldunk (a ligációs puffer összetétele a következő: 250 mmól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH 7,8, 50 mmól/1 magnézium-klorid, 25 mmól/1 iitio-treitol és 25% glicerin), és az oldathoz 4,67 ul vizet adunk. Ha 10 percen át 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd 3 pl, 0,66 mmól-os AXP és 0,33 pl (2 egység/pl) T dezoxi-ribonukleinsav Jigáz-oldatot adagolunk. A kapott ligációs elegyet 1,5 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, amiután megkapjuk a pPR12 plazmidot. Az így előállított plazmid dezoxi-ribonukleinsavat felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. 7. példa A pPR12 plazmid traaszformálása E. coli K12 C600Rk-Mk-sejtekbe A transzformációt a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pPR3 plazmid helyett a pPR12 plazmidot használjuk. A transzformánsokat úgy szelektáljuk, hogy vizsgáljuk immunitásukat lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 bakteriofágokkal szemben. A vizsgálatokat 32 °C hőmérsékleten végezzük. A rekombinánsok Ap’ és Tá karakterét vizsgáljuk, és 32 °C hőmérsékleten megállapítjuk lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 immunitásukat és megvizsgáljuk 42 °C hőmérsékleten érzékenységüket lambdaKH54h!ambda és IambdaKH54h80 bakteriofágokkal szemben. Egy transzformánst kiválasztunk, és E. coli K12 O600Rk-Mk-/pPRl2 jellel jelöljük. Ezt u túlélő telepet megvizsgáljuk a várt fenotípusra, és lehasználjuk a pPR12 plazmid sokszorosítására és izolálására. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
