197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
21 1S7043 22 centrifugálássaí ülepítjük, 75%-os etanollal mossuk és szárítjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmens izolálását poliakrilamid gél-elektroforézissel, elektroeluálással, DEAE-cellulóz kromatográfiával és etanolos kicsapással végezzük, ahogy azt az előzőekben megadtuk. A dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi összetételű TE-pufferban újra oldjuk: 1 mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav, 10 mmól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH — 7,8. B) A p!B7A4Al plazmid emésztése BamHI restrikciós enzimmel A p!B7A4Al plazmid hasítását 37 °C hőmérsékleten végezzük 50 pl, 20 mmól/1 trisz-hidrogén-kloridot, pH — 7,0, 100 mmól/1 nátrium-kloridot, 7 mmól/1 magnézium-kloridot, 2 mmól/12-merkaptoetanolt és 10 egység BamHI restrikciós endonukleázt tartalmazó reakcióelegyben. C) A lambda cl fragmens ligálása a BamHI enzimmel emésztett pIB7A4Al BglJI végeihez A T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal való ligálást 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben végezzük: 1.4 pg, 2,5 kb nagyságú BglII fragmens (a 3A) példa szerint állítjuk elő), 1.5 pg, a 3B) példa szerint előállított, BamHI enzimmel hasított pIB7A4Al dezoxi-ribonukleinsav, 50 mmól/1 trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,8, 10 mmól/1 ditio-treitol, 5% glicerin, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 0,1 mmól/1 ATP és 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz. A reakcióelegyet 4 'C hőmérsékleten inkubáljuk 18 órán át, majd a reakció leállításáia 5 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk. Az, így előállított pPR3 plazmidot további felhasználásig 4 ”C hőmérsékleten tároljuk. 4. példa A PR3 plazmid transzformálása E. coli K12 C600Rk—MK-sej tekbe Az E. coli K12 C600Rk-Mk- friss, 16 órás tenyészetével [lásd Chang és Cohen, Proc. Hat. Acad. Sei., 71, 1030-1034 (1974)] 1:10 arányban friss Lrlevest oltunk [lásd Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs,, Cold Spring Harbor, New York (1972)], és a tenyésztést 1 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük. A 660 Klett-egységnyi sűrűségű sejttenyészetet centrifugáljuk, a sejteket 2,5 m! 100 mmól/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal mossuk, és ezután 150 mmólos, 10% glicerint tartalmazó kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk. Ezután 20 percen át szobahőmérsékleten inkubálunk. A sejteket centrifugálássaí összegyűjtjük, 0,5 ml kalciumklorid-glicerin-oldatban szuszpendáljuk, 3—5 percen át jégfürdőben tartjuk, majd lefagyasztjuk. A sejtszuszpenziót felhasználásig folyékony nitrogén alatt tartjuk. Az előkészítés és a tárolás nem befolyásolja az élőképességet vagy a kovalensen kapcsolt, kör alakú dezoxi-ribonukleinsawal végzett transzformálást. A sejteket jégfürdőben felolvasztjuk és 0,1 m! sejtszuszpenziót 0,05 ml dezoxi-ribonukleinsawal elegyítünk (5 pl, a 3C) példában megadottak szerint előállított pPR3 dezoxi-ribonukleinsavat 45 pl 0,1 XSSC-oldatíal /standard nátrium-klorid-citrát-oldat) elegyítünk. Az így előállított mintákat 20 percen át jégfürdőben hűtjük, 1 percen át 42 “C-ra helyezzük, további 10 percen át hűtjük jégfürdőben, majd 0,85 ml Hevessel hígítjuk, és ezután 2 órán át 32 °C hőmérsékleten inkubálunk. A tenyészeteket L-agarra (lásd Miller, 1972) szélesztjük, úgy, hogy 1X109 lambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 egységet kapjunk [lásd Backman és munkatársai, Science, 196, 182 (1977)]. A tenyészeteket 32 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A trans/.fonnánsokiU úgy szelektáljuk, hogy 32 °C hőmérsékleten vizsgáljuk a lambdaKH54híambda és a lambdaKH54h8ö bakteriofágokkal szembeni immunitást. A rekombinánsokat 32 °C hőmérsékleten Apr, Te5 karakterre, IambdaKH54hlambda és lambdaKH54h80 immunitásra, továbbá 42 °C hőmérsékleten lambdaKH54hlambda és IambdaKH54h80 érzékenységre vizsgáljuk. Egy transzformánst szelektálunk, és E. coli K12 C60ÓRK-MK-/pPR3 jellel jelöljük. Ezt a túlélő telepet a várt fenotípusra vizsgáljuk, és felhasználjuk az előállított pPR3 rekombináns plazmid sokszorosítására és izolálására. A pPR3 plazmid restrikciós enzimes analízise azt jelzi, hogy nem a lamda cl, hanem a lambda rex gén esik közelebb a triptofán E-inzulin B lánc génjéhez. 5. példa A PR3 plazmid sokszorosítása és izolálása Az E. coli K12 C600RK-MK-/pPR3 plazmid dezoxi-ribonukleinsavát klóra mfen ikollal sokszorosítjuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat tisztított lizátummódszerrel izoláljuk [lásd Bazaral és Helinski, J. Mól. Bioi., 36, 185—194 (1968)]. A kovalensen zárt, kör alakú dezoxi-ribonukleinsavat céziumklorid és propidium-dijodid egyensúlyi ultra-centrifugálással tisztítjuk. A propidium-jodidot 2-propanollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat cézium-kloridban tároljuk —20 °C hőmérsékleten. A dezoxi-ribonukleinsav munkaoldatait SSC/10 pufferban oldjuk (0,015 mól/1 nátrium-kiorid, 0,0015 mói/1 nátrium-citrát, pH — 7,0), oly módon, hogy Sephadex PD10 gyantán kromatografáljuk (Pharmacia, 800 Centennial Ave, Piscataway, New Jersey 08851). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
