197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
1 197 043 A találmány olyan .szelektív rendszerre vonatkozik, amelynél lehetőség nyílik rekombínáns dezoxi-ribonukleinsavat hordozó gazdasejtek stabilizálására és szelektálására egy rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektorban lévő gén által represszált letális kromoszomális marker használatával. Ez igen fontos, mivel a rekombináns dezoxi-ribonuklcinsavklónozó vektorok, például a plazmidok, gyakran igen gyorsan elvesznek a baktériumpopulációbói, ugyanakkor az ipari méretű fermentációk több mint 101S sejtet igényelnek. így. ha egyszer az adott terméket meghatározó rekombináns dezoxi-ribo nukleárisa vat beépítjük egy piazmidba, előnyös, ha nem alapvetően lényeges, hogy a plazmidot tartalmazó mikroorganizmus-tenyészetet oly módon stabilizáljuk, hogy a tenyészetben lévő összes sejt tartalmazza ezt az adott plazmidot. Ez azért döntő, mivel az idegen dezoxi-ribonuk- Icinsavat tartalmazó rekombináns plazmidok közismerten instabilak, és a tenyészetben lévő sejtek gyakran több mint 90% -a nem tartalmazza a rekombináns nlazmidot egy éjszakán át való növesztést követően, így a termelőképesség drámaian csökken, mivel az adott gén kifejeződése csak azokban a sejtekben lehetséges, amelyek a plazmidot tartalmazzák. Kuang és munkatársai a Nucl. Acids Proteins Proc. Symp. (1979) előadásukban lambda bakteriofág DNS-ből származó restrikciós íragmens klónozását ismertetik, mely DNS többek között a d és a cro gént is tartalmazza, klónozó vektorként pBR322 plazmidot alkalmazva. Az így nyert, lambda-fragmenst tartalmazó plazmád megfelelő gazdasejtbe transzformálva képes arra, hogy’ megakadályozza a behatoló lambda bakteriofág DNS átírását, és így immunitást okoz a transzformált gazdasejtben. Ugyanakkor azonban, a Kuang ás numkatársai-féle plazmid nem képes funkciós polipeptid kifejezésére. Ugyanakkor a találmány szerinti eljárásban olyan klónozó vektorokat használunk, melyek tartalmazzák a cl represzszor gént, de egyáltalán nem a cm gént, és a rex génnek csupán egy részét, és így kiválóan alkalmasak rckonibinánsDNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelektálására, és ezzel egyidejűleg maximalizálják a gén kifejezést és a funkcionális polipeptid bioszintézisét. A találmány tárgya eljárás funkcionális polipeptidet kifejező rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó EL coli gazdasejtek stabilizálására és szelektálására. Úgy járunk el, hogy a lambda bakteriofág d represszort tartalmazó Psíl-Hincll restrikciós fragrnensét és egy funkcionális polipeptidet kifejező gént tartalmazó rekombináns DNS klónozó plazmáddal E. coli gazdasejteket transzformálunk, és a transzformáit E. coli gazdasejteket funkcionális cl represszort nem termelő lizogén organizmussal lizogenizáljuk, amely azonban a transzformált gazdasejtekben levő rekombináns DNS klónozó vektorban jelenlevő represszor gén által represszált állapotban van, azzal a feltétellel, hogy a rekombináns DNS klónozó vektor a represszotra nem érzékeny repiikont és promoted tartalmaz, A találmány tárgya továbbá eljárás a gazdasejtek stabilizálására és szelektálására használt módszer során alkalmazott rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektorok és a vektorokkal transzformált gazdasejtek előállítására. 9 Igen kevés hatékony módszer ismeretes a rckombináns plazmidok stabilizálására, és minden ismert eljárásnak komoly hátrányai vannak. Az egyik módszer szerint a rekombináns pluzmidokba antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket építünk be, és ezután a tenyészethez hozzáadjuk a megfelelő antibiotikumot. A plazmidot tartahnazó és antibiotikum rezisztenciát meghatározó gént hordozó sejtek szelektálódnak, ugyanakkor azok a sejtek, amelyek a plazmidot elvesztik, elpusztulnak és így eliminálódnak a tenyészetből. Ennek az eljárásnak a legnagyobb hátránya az, hogy nagy térfogatban kell növesztenünk antibiotikumra rezisztens baktériumokat, a fenneníációs táptalajban drága antibiotikumok vannak jelen, továbbá az adott terméktől az antibiotikumot el kell különítenünk. A másik ismert módszer szerint a rekombináns plazmidok stabilizálására úgy járunk el, hogy kromoszomális auxotróí mutációt komplementálunk. Ez szerint eljárva, a fermentációs táptalaj összetételét igen gondosan kell megválasztanunk, és olyan táptalajban keil tenyésztenünk, amely nem tartalmazza a gazdabaktérium számára szükséges tápanyagot. Ezen felül a szintrofizmus miatt a sejtek a plazmid elvesztését követően is növekszenek. így a szelekció a táptalaj specifikus manipulációjától függ. Az ilyen eljárások növelik a fermentációs költséget, és limitálják a termelőképesség fokozásának lehetőségeit, Szükségünk van olyan más szelekciós módszerekre, amelyek függetlenek a táptalaj összetételétől, amelyek lehetővé teszik az összes fermentációs körülmény között a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektor megtartását, és amelyek lehetővé teszik a polipeptid termék fokozott bioszintézisét. Ezt az igényt kielégítik az olyan önpusztító sejtek, amelyekben a kromoszóma letális markert tartalmaz, és amelyek rekombináns dezoxi-ribonukleinsavklónozó vektoraiban egy represszor vagy egy komplemen - táíó gén van jelen. Ilyen körülmények között azok a sejtek, amelyek elvesztik a vektort, elpusztulnak. A jelen szabadalmi leírás szerinti eljárás során továbbfejlesztjük ezt az alapgondolatot oly módon, hogy nemcsak gyakorlatilag az összes tenyészetbenjelenlévő sejt hordozza az adott rekombináns klónozó vektort, de a klónozó vektorban lévő gének kifejeződése is fokozódik. Különben előnyös a gének termékeinek fokozott kifejeződése és a plazmid szegregációjának megszüntetése, ez k ülönbözteti meg a jelen találmány szerinti eljárást más, szintén a lambda cl bakteriofág re p részszórt felhasználó szelektív rendszerektől. Leírnak olyan szelektív rendszert, amely tartalmazza mind a lambda bakteriofág 2,5 kb Bg!I!,cI represszort tartalmazó restrikciós fragmensét, mind pedig egy funkcionális polipeptidet kifejező gént. Bár a funkcionális polipeptidet kifejező gén kifejeződik, a plazmid bizonyos szegregációt szenved, és nem következik be a termék fokozott ás optimális termelése. A találmány szerinti új eljárás ezeket a nehézségeket áthidalja oly módon, hogy lehetővé teszi a rekombináns dezoxi-ribomikleinsavat tartalmazó gazdasejtek stabilizálását és szelektálását, ugyanakkora gén kifejeződése maximális mértékben bekövetkezik, és a funkcionális polipeptid bioszintézise fokozódik. Transzformáció alatt azt értjük, hogy dezoxi-iibog :0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
