197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
17 197042 18 alvadjon. A vizsgálandó minták hígításait és egy ismert koncentrációjú urokináz standard-oldat hígításait visszük be 5 pl térfogatban a tartályokba, kilyukasztva a gélt, majd a lemezeket nedveskamrában 37 °C-on inkubáljuk 17—20 órán át. A lízises területek átmérőit lemérjük. Az urokinázra kapott adatokból standard görbét veszünk fel úgy, hogy az átmérők négyzete logaritmusának függvényében felvesszük a koncentrációk logaritmusát. A minták aktivitásának mértékét a standard görbe alapján határozzuk meg. Úgy látszik, hogy az urokináz 10—100 egység/ml tartományban megfelelő standardul szolgál a tPA aktivitás meghatározásához. A transzficiált sejtvonal tápoldatában levő öszes tPA proteint ELlSA-val határozzuk meg. Az ELISA vizsgálatot Nunc-féle immun-assay lemezeken [Nunc, Dánia] végezzük, melyeket 0,05 mólos nátrium-karbonátban (pH=9,6) oldódott 2 pg/ml, kecskében termelt poíiklonális anti-tPA-val (Biopool, Svédország) fedünk 1 órán át 37 °C-on. A lemezeket ezután 0,05 mólos nátrium-karbonátban (pII—9,6) oldott 0,5%-os Ilammersten kazeinnel 1 órán át 37 °C-on blokkoljuk. A fedett és blokkolt mikrotitráló lemezeket és a mosási szakaszokban levő lemezeket 0,02% Tween 20-taríalmú, foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal mossuk. A vizsgálandó mintákat a mintapufferrel (0,1 mól trisz-HCl, pH = 7,0 150 mmól NaCl, 0,5% kazein, 0,02% Tween 20) hígítjuk. Az ebben a vizsgálatban használt standard kettős láncú tPA (Biopool, Svédország). A mintákból 100 pl-eket mérünk a tartályokba, és a lemezeket 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk rázással. A lemezeket ezután mossuk, majd a tartályokba 100 pl egér monoklonális anti-tPA antitestet (MACO10, 1 pg/ml mintapuffer) mérünk. A lemezeket szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk rázogatással. A monoklonális antitesttel való inkubálás után a lemezeket mossuk, majd minden tartályba 100 pl kecskében termelt anti-egér IgG Fc specifikus peroxidáz-konjugátumot mérünk be, és újra 1 órán át inkubáljuk, szobahőmérsékleten, rázással. A lemezeket a konjugátummal való inkubálás után mossuk, majd a vizsgálatot Bős és munkatársai [1981] által leírt módon végezzük a továbbiakban. 10 15 20 25 30 35 40 45 4. Fibrin-agaróz-lemez módszer A tPA meghatározásához transzficiált sejteket r.g (körülbelül 5 • 106 sejt) kaparunk le a lemezről, a J sejtek 10%-át kétszer mossuk szérummentes DMEM (Gibco) oldattal, melyet 1 mmól piruváttal; 50 NE/ml penicillinnel 50 pg/ml sztreptomicinnel (P/S) és 2 mmól L-glutaminnal (Gin) égé- rl5 szítettünk ki. A sejteket ezután 7 ml olyan tápoldatban szuszpendáljuk, amelynek összetétele 70% DMEM (mint fent), 10 térfogat% savval kezelt magzati boíjúszérummal (FCS) kiegészítve és 30 térfogat% Hanks-oldat (Hanks balanced salts; go Gibco) 2,5% alacsony alvadási hőmérsékletű agarózzal (Sigma Ltd.) kiegészítve 42 'C-on. A szuszpenzióhoz ezután 0,5 egység trombint (marhaplazmából előállított, 500 E/ml értékű trombin; Sigma Ltd.) adunk, végül 1,5 ml DMEM oldatot, 1 mmól 65 piruválot, P/S-t, L-ghilamint, 10 térfogat% savval kezelt FCS-t, 30 mg/ml fibrinogént (marhavérből előállított I—S típusú fibrínogén; Sigma Ltd.), s a keveréket ezután rögtön kiöntjük 90 mm-es csészébe. A csészéket ezután 48 óráig inkubáljuk, hogy meghatározzuk a transzficiált sejtek által termelt tPA-szintet. Az eredményeket mint relatív fibrinolitikus aktivitási értékeket adjuk meg. 5. tPA-t termelő sejtvonal A tPA-t termelő pPRI 1/10 sejtvonal az YB2/ 3.0—Ag20 patkány hibridoma sejtvonalból származik, ha az YB2/3.0—Ag20 sejteket a pPRI-el transzficiáljuk. YB2/3.0-—Ag20 (maximális értékek) Plazmid Promoter tPA egység/ml tenyészet (maximális szint) pPRI RSV LTR 900 6. A pPRI 1H0 sejtvonal szakaszos tenyésztése tápanyag-adagolással, levegőztetettfermentorban A kísérletnek az volt a célja, hogy megállapítsuk a pPRI 1/10 scjtvonal növekedését és tPA szintetizálását egy üzemileg termelő sejttenyésztő reaktorban. A használt sejtreaktor 5 liter hasznos térfogatú, levegőztetett fermentor (airlift fennen ter=ALF) volt, az oldott oxigéntenzió (DOT), pl I és hőmérséklet automatikus szabályozásával. A DOT szabályozása levegő vagy oxigén injektálásával történik, nitrogén vagy levegő vivőgázzal való keverés révén. A pH szabályozását úgy oldjuk meg, hogy széndioxidot injektálunk ebbe a gázkeverékbe, illetve lúgot adagolunk a tenyészethez tápszivattyúval. A hőmérséklet szabályozása úgy történik, hogy szabályozott hőmérsékletű vizet folyatunk át a reaktor köpenyén. A pPRI 1/10 sejtvonal fenntartását rutinszerűen, hengeres tenyésztőedényben végezzük a Dulbecco által módosított Eagle tápoldatban (DMEM), melyet 10 térfogat%, hővel inaktivált magzati boíjúszérummal (FCS) egészítünk ki. A fermentoros tenyésztéshez szolgáló táptalaj szérummentes összetételű táptalaj, melynek alapja a DMEM, kiegészítve albuminnal, inzulinnal, transzferrinnel, etanol-aminnal, kolinnal, vitaminokkal, nyomelemekkel és egy nyíróerő ellen védő polimerrel. A fermentoros tenyészethez a sejt inokuhtmot szérummal kiegészített táptalajon tenyésztjük. A sejteket centrifugálással ülepítjük, majd a fermentorba való beoltás előtt szérummentes termelő táptalajban reszuszpendáljuk. A fermentoros tenyésztő
