197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
19 197 042 20 a) egyszeri glutaminadag oly módon, hogy a tenyészetben 2 mmóllal emeijük a végkoncentrácidt; b) az „oldhatatlan” triptofán, tirozin és cisztein aminosavakat egy adagban bevisszük; c) a glükózt, kohnt és az „oldható” aminosavakat tápszivattyúva! adagoljuk. A tenyészetből naponta mintákat veszünk. A sejtszámot módosított Fuchs—Rosenthal-kamra használatával és az élőcsíra-számot tripánkék festéssel való kizárásos módszerrel állapítjuk meg. A tenyészet felülúszójából alikvot mennyiségeket fagyasztunk le folyékony nitrogénnel, majd —70 °C- on tároljuk e mintákat a tPA-nak tPA—ELlSA-val és fibrin-agaróz-lemez módszerrel való meghatározásáig. A 4. ábra a pPRI 1/10 sejtek növekedésének és az általuk szintetizált tPA mennyiségének a profilját mutatja be, fermentoros tenyésztés esetén, A sejtek maximálisan 2,2- lüVml csítaképes sejtpopuláció-sűrűséget és maximálisan 4 • lüVnfi összpopulácid-sűrűséget érnek el. A tPA az egész tenyésztés folyamán szintetizálódik és 42 pg/ml maximális koncentrációt ér el fibrin-agaróz-lemez módszerrel meghatározva, illetve 38 pg/ml-t tPA—ELISA-val mérve. A szoros egyezés az ELISA (amely mind az aktív, mind az inaktív tPA-t méri) és a fibrin-agaróz-lemez módszer közt azt mutatja, hogy a tPA szintézis mindvégig élénk volt. Bár a találmány kiviteli módját csak a fent leírt példákkal ismertettük, az eljárás részleteinek módosítása szintén a találmány oltalmi köréhez tartozik. tés folyamán kiegészítő tápanyagokat adagolunk. Ezek a következők: Irodalomjegyzék Southern, P. J. and Berg, P., Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 Early Region Promoter. .T. Mol. Applied Genetics, 1982; 1:327-341. Banerji, J., Olson, L. and Schaffner, W. A., Lymphocyte specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunglobulin heavy chain genes. Cell (1983) 33: 729—740. Graham, F. L., and A. J. van der Eb., A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology (1983) 52: 456—467. Potter, H., Weir, L., and Leder, P., Enhancer-dependent expression of human R immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B> lymphocytes by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1984) 81: 7161-7165. Lopata, M. A., Cleveland, D. W., and Sollner- Webb, B., High level transient expression of a chloramphenicol acetyl transferase gene by DEME- dextrau mediated DNA transfection coupled with a dimethyl sulfoxide or glycerol shock treatment. Nucleic Acids Res. (1984) 12: 5707-5717. Luthman, H., and Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of cloroquinine treated cells. Nucleic Acids Res. (1983) 11: 1295-1308. Bos, E. S,, Vander Doden, A. A., Van Roog, N., and Schrums, A. H. W. M. (1981) J. Immunoassay 7, 187-204. Maniatis, T., Fritsch, E. E, and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning (a laboratory manual), Cold Spring Harbor Laboratory. Pcnnica, D., Holmes, W. E., Kohr, W. J., Harkins, R. N., Vehar, G. A., Ward, C. A., Bennett, W. F., Yelverton, E., Seeburg, P. H., Heyneker, H. I-, Goeddel, D. V., and Collen D. (1983). Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E. coli. Nature 301: 214—221. Hammer, D., and Walling, M. (1982). Regulation in vivo of a cloned mammalian gene: cadmium induces the transcription of a mouse metallothionein gene in SV40 vectors. J. Mol. Appl. Genet. 1: 273-288. Harris, T. J., Patel, J., Stephens, P., Kenten, J., Marston, F. A., Little, S., Emtage, J. S., Gpdenakker, G., Volckaert, G., Rombnuts, U., Hiilau, A., ind De Somer, P. 1986. Cloning of cDNA coding "or human tissue plasminogen activator and its expression in recombinant prokaryotic and eukaryotic cells. Glanville, N., Dumám, D. M., and Paliniter, R. D., 1981. Structure of mouse metallothionein—1 gene and its mRNA. Nature 292—269. Gorman, C. M., Merlino, G. T., Willingham, M. G, Pastan, I. and Howard. B. M., 1982. The Rous Sarcoma Virus long terminal repeat is a strong promoter when introduced into a variety of eukaryotic cells by DNA-mediated transfection. Proc. Natl, Acad. Sei. U.S.A., 79: 6777-6781. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás állati eredetű sejtek szakaszos tenyésztésére és ezen az úton sejttennékek előállítására a sejteket táptalajban tenyésztve, azzal jellemezve, hogy a tenyésztés alatt a táptalajt egy vagy több energiaforrásból és egy vagy több aminosavból, előnyösen glutaminból álló kombinált tápanyaggal és kívánt esetben a sejtek szaporodása következtében kimerült más tápanyagokkal kiegészítjük és a tenyésztést a tenyészet csökkenő fázisában is folytatjuk, és kívánt esetben a keletkezett sejtlermékeket kinyerjük. 2. Az l. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiegészítő tápanyag adagolását a tenyésztés exponenciális szaporodási fázisában kezdjük meg. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiegészítő tápanyag adagolását a tenyésztés exponenciális szaporodási fázisa után is folytatjuk. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiegészítő tápanyag adagolását összesen 30—100 órán át végezzük. 5. Az. előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tápanyag energiaforrás komponenseként cukrot alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 S0 65 11
